本发明专利技术涉及一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。本发明专利技术可用于转基因成分定量检测，根据标准曲线在25～200ng/mL范围内线性良好，可实现对样品的高特异性和高灵敏度检测。该方法采用夹心ELISA法，敏感、特异、操作方便。
【技术实现步骤摘要】
—种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测领域，具体来说涉及人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用。
技术介绍
在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人乳铁蛋白基因奶牛已经通过了农业部规定的中间试验、环境释放、生产性试验，距离获颁最终的农业转基因生物安全证书仅有一步之遥。由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测这些已上市或即将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人乳铁蛋白成分检测试剂十分必要。目前用于检测乳铁蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人乳铁蛋白的报道却并不多。王燕平等建立了一种人乳中乳铁蛋白ELISA检测方法，为间接ELISA法，摸索了 ELISA操作的工作条件，检测人乳铁蛋白的限度为1.56?100ng/mL。该方法针对标准品检测灵敏度高，但针对样品的检测灵敏度低。双抗体夹心ELISA又称抗原捕捉ELISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人乳铁蛋白转基因成分双抗体夹心ELISA检测方法的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于定量检测转基因成分。本专利技术另一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒检测人乳铁蛋白的方法。本专利技术再一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。本专利技术提供的人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。其中，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgGl+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白(bLF)反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。杂交瘤细胞ZZY hLF 3D12的保藏号为:CGMCC N0.6394 ;保藏时间:2012年7月20日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。Western Blot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。其中，所述人乳铁蛋白多克隆抗体是以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1: 200，000。其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种:I)洗涤液；2)底物显色液；3)反应终止液；4 )人乳铁蛋白标准品。所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H2S04。所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤:I)向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；2)加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗涤液洗板；3)加入底物显色液显色,加入反应终止液终止反应,测定0D450值；4)以人乳铁蛋白抗原标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品人乳铁蛋白的含量。具体包括以下步骤:I IgG标准曲线的建立:将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；力口入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；II检测样品中人乳铁蛋白的含量:将人乳铁蛋白多克隆抗体包被于酶联板上，洗板；封闭经包被的酶联板，洗板；力口入待检测样品，洗板；加入酶标人乳铁蛋白单克隆抗体，洗板；加底物显色；终止反应；测定0D450值，通过与标准曲线比对，定量检测人乳铁蛋白。优选地，人乳铁蛋白多克隆抗体浓度为5 μ g/mL,包被液为pH9.6磷酸缓冲液，酶标人乳铁蛋白单克隆抗体稀释倍数为1:500。具体实施步骤如下:I IgG标准曲线的建立:(I)包被:浓度为5 μ g/mL兔多克隆抗体，100 μ L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；(2)封闭:加150 μ L/孔封闭液，37°C 2小时后，洗涤3次，拍干，置4°C冰箱保存备用；(3)加标准样品:混合转基因样品和非转基因样品制备人乳铁蛋白抗原标准品，标准品原始浓度为0.2mg/mL，分别按照 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 稀释，PBS作为阴性对照；加入不同浓度的人乳铁蛋白抗原标准品溶液100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；(4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；(5)显色:TMB 按 10(^17孔加入，37°〇`显色 15_30min ；(6)终止:加入终止液2M H2S0450 μ L/孔；(7)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，建立标准曲线；II检测样品中人乳铁蛋白的含量:(I)包被:浓度为5 μ g/mL兔多克隆抗体，100 μ L/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；(2)封闭:加150 μ L/孔封闭液，37°C 2小时后，洗涤3次，拍干，置4°C冰箱保存备用；(3)加待测样品:加入待测样品，100 μ L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；(4)加二抗:小鼠单克隆抗体-HRP抗体，按1:500的稀释比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；(5)显色:TMB 按 10(^17孔加入，37°〇显色 15_30min ；(6)终止:加入终止液2M H2S0450 μ L/孔；(7)读数:以450nm单波长测定各孔OD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中，所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中，所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂中的一种或几种: 1)洗涤液； 2)底物显色液； 3)反应终止液； 4)人乳铁蛋白标准品。5.根据权利要求4所述的试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱振营，刘建，林祥梅，吴绍强，付伟，李风翠，仇松寅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。