辣木种子蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及一种从辣木（Ｍｏｒｉｎｇａ）种子中获取的或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质新家族。该族蛋白质可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂以及／或作为抗生剂。该新蛋白质家族包含至少５个亚家族：Ａ首先根据重组方法获得。其他亚家族根据特定的提取方法获得。本文中将根据本发明专利技术中提取方法获得的蛋白质称为Ｅ蛋白质。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从辣木种子中获取的或衍生自辣木种子蛋白质的蛋白质。更确切的说，本专利技术涉及从辣木种子中获取或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质家族，其可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂。现有技术辣木属包含14个植物种，特别如辣木(Moringa oleifera)。辣木种子主要用于制取一种可通过机械压榨提取的食用油。已发现辣木种子中含有可作为污水处理中凝聚剂的水溶性、低分子量、高碱性蛋白质。这些活性化合物中的一部分已得到分离和鉴定(Gassenschmidt，U.，Jany，K.-D.，Tauscher，B.，and Niebergall，H.(1995).Isolation and characterization of a flocculatingprotein from Moringa oleifera Lam.Biochim.Biophys.Acta 1243，477-481)。其中一种蛋白质部分——MO2.1经测定表明其含有60个氨基酸，并具有高含量的谷氨酸、精氨酸和脯氨酸。国际专利申请WO99/48512(LABORATOIRES SEROBIOLOGIQUES)公开了从辣木种子提取的蛋白质中至少一种蛋白质部分在化妆品或者皮肤病领域中的用途，例如MO2.1。国际专利申请WO 00/46243(OPTIMA ENVIRONNEMENT SA)涉及此类提取自辣木种子并可作为凝聚剂的蛋白质以及制备这些蛋白质的特殊方法。专利技术简述本专利技术涉及一种从辣木种子中获取的或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质新家族。这些蛋白质可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂以及/或作为抗生剂，特别是它们有效杀灭人类病原体，包括具有抗生素抗性的临床分离物。该新蛋白质家族包含至少5个亚家族A首先根据重组方法获得。其他亚家族根据特定的提取方法获得。本文中将根据本专利技术提取方法获得的蛋白质称为E蛋白质。本文中的术语“抗生”特别指抑制细菌、杀菌、抗真菌或者对其他任何种类细胞有毒性以及抗病毒。必须提到的是，在此之前表达重组形式的辣木蛋白质的尝试已经在现有技术中公开(Tauscher，B.(1994).Water treatment byflocculant compounds of higher plants.Plant Res.And Dev.40，56-70)，并且为证明相关凝聚活性的尝试没有成功。本专利技术的专利技术者开发了一种方法来获得细菌生产、有活性的重组蛋白质。E蛋白质与现有技术中公开的辣木蛋白质相比具有不同的结构。根据本专利技术，该蛋白质族作为凝聚剂不仅可用于水，还可以用于其他流体，比如血液、乳汁或其他任何可食用液体。它们还可以用于制药和化妆品领域，特别参照WO 99/48512中引用的所有说明。和本专利技术相关的一些实施例将在后面与下面的图一起进行讨论附图简述附图说明图1.Flo表达和纯化的示意图。图2.Flo蛋白质的表达。图3.Flo凝聚活性分析。图4.Flo对大肠杆菌(E.coli)培养物生长的影响。图5.辣木的种子蛋白质提取物、油脂体蛋白质和合成肽的SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)图示。图6.还原条件下提取的辣木的种子蛋白质提取物和合成肽的SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)图示。图7.在pH为7、50mM的KPO4中的总样分析特性。图8.MHB营养肉汤中的总样分析特性。图9.MHB营养肉汤以及pH为7、50mM的KPO4缓冲液中使用Flo杀灭金黄色葡萄球菌(S.aureus)P8。图10.DNA序列以及H1、H2和H3相应的肽序列。专利技术详述在本专利技术接下来的实施例中将详细描述重组方法以及从辣木种子中提取E蛋白质的特定方法。所制取得蛋白质将与一种辣木种子提取物的商业制剂PHYTOFLOC进行比较。简单说来，制取PHYTOFLOC需将一块辣木种子的碾压饼(ground presscake)与盐水按照1∶5的重量/体积比混和。过滤提取物并在75℃加热。离心除去沉淀的固体，并通过5kD截断膜过滤将上清液浓缩。材料和方法质粒设计一段编码MO2.1多肽序列的DNA序列(Gassenschmidt等人，1995，参见图.1A)。本文中将该多肽的重组形式称为Flo。寡聚核苷酸双链由Horton等人(1989)描述的PCR装配方法合成。设计寡聚核苷酸序列，使其密码子最适于大肠杆菌的表达，且在其两末端设计有SapI和PstII限制性酶切位点。选用IMPACT表达系统(InteinMediatedPurification with anAffinityChitin-bindingTagsystem，New England Biolabs，Inc.)的pTYB11质粒在大肠杆菌中对辣木种子Flo蛋白质进行克隆和表达。将寡聚核苷酸与SapI/PstI消化后的pTYB11载体连接，从而将编码靶蛋白质Flo的N末端的序列、一个内部蛋白质自剪切位点(内切子intein)以及几丁质结合区域融合。通过测序确定阳性克隆。蛋白质表达和纯化pTYB载体使用Lac阻遏蛋白调控(阻遏调控)的T7启动子和lacI基因使融合基因的表达得到严格的调控。在缺乏IPTG诱导时，紧贴T7启动子下游端的lac操纵子序列与lac阻遏蛋白结合抑制了融合基因的基础表达。大肠杆菌菌株为ER2566，携带有在lac启动子调控下的T7 RNA聚合酶基因的一个染色体拷贝。诱导融合蛋白表达时，在A600值为0.5-0.6的指数生长培养物中加入0.3mM IPTG，27℃下200rpm摇动2小时。细菌培养、提取物制备和纯化条件和所用的缓冲液根据制造商(New England Biolab)的推荐使用。简单说来，将1.5升体积细菌培养物(A600＝0.5-0.6)离心，用超声波破碎细胞。离心使提取物澄清并加到平衡后的几丁质珠(颗粒大小为50-100μm)的柱上。经过清洗，将柱用含有50mM DTT的缓冲液填满，在室温下在柱上温育40小时，使带有intein(内切子)的融合肽进行自我剪切。将Flo洗脱并用凝胶电泳验证其存在。最后，用剥离缓冲液洗脱前体蛋白，使柱再生。总细胞蛋白质提取物使用10％SDS-Page凝胶(Laemmli，1970)进行分析。为进行蛋白质定量分析，凝胶用cypro-orange染色并使用扫描软件(STORM 840，Pharmacia Amersham biotech.)分析。通过该方法可以直接与平行加入的不同量的牛血清白蛋白(BSA)进行比较来估计融合蛋白在总提取物中的比例。由于洗脱下的Flo多肽分子小，因而使用N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)钠十二烷基硫酸聚丙稀酰胺凝胶电泳(Schagger等人，1987)分析。之后使用适合小分子量碱性蛋白质的方案进行凝胶固定和染色(Steck等人，1980)。化学合成蛋白质本专利技术的一些重组蛋白和E蛋白质根据标准程序通过合成得到。E蛋白质-实施例1从辣木种子中制备粗的油脂体蛋白质提取物辣木的干种子用手工去壳，最大功率下使用Polytron，在4倍体积的冷(4℃)匀浆缓冲液(含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇和0.6M蔗糖的0.15MN-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液)中工作40秒使本文档来自技高网...

【技术保护点】
根据重组方法获得的蛋白质，该方法包含以下步骤：－使用已知的辣木蛋白质序列，－重新构建最适在大肠杆菌中表达的合成基因，－设计表达蛋白质的表达载体，优选作为与由内切子序列以及几丁质结合结构域组成的异源多肽的融合形式， －用ＩＰＴＧ诱导表达，－将制备物上样到柱上，优选上样到含几丁质珠的柱上，－洗脱并回收天然的细菌表达的蛋白质，优选通过用含硫醇的还原化合物温育来切割融合蛋白后进行。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：N默莫德，IW马里森，SC多里斯，E迈耶，M苏里兹，
申请(专利权)人：最佳环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]