本发明专利技术涉及一种制备稳定、可溶的淀粉状蛋白β（Ａβ）低聚物的方法及其组合物，其用作抗原，其中所述抗原用于产生治疗阿尔茨海默氏病和其它与淀粉状蛋白β的异常聚集有关的病症的抗体。该方法使用超过７．０的ｐＨ和高的Ａβ浓度，所述方法任选包括使用二价阴离子或螺旋－诱导性溶剂来形成低聚物。用动态光散射技术测量时，由本申请的方法制备的Ａβ低聚物具有直径为１０－１００ｎｍ的粒度，和１００－５００ｋＤａ的分子量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组合物和用于制备稳定的高分子量淀粉状蛋白卩低聚物的方法 专利
本专利技术涉及一种制备稳定的淀粉状蛋白P低聚物的方法及其组合 物，其用作抗原或筛选试剂，其中所述抗原或筛选试剂用于产生治疗或 诊断阿尔茨海默氏病和其它与淀粉状蛋白卩的异常聚集有关的病症的抗体。专利技术背景目前对于阿尔茨海默氏病只有有限的治疗方法，该疾病已成为多方 面的全球公共健康问题。该疾病的特征在于与神经纤维缠结和淀粉状蛋白斑的聚集有关的渐进性痴呆，所述后者含有淀粉状蛋白P(AP), —种 包含39-43个由膜蛋白前体、淀粉状蛋白前体蛋白(APP)发生蛋白质水解 衍生来的氨基酸的两亲性肽(综述参见Lee, V.M.等人，Annu. Rev. Ne腦sci. ， 24: 1121-1159(2001), Klein, W丄.，Molecular Mechanisms of Neurodegradative Diseases。 Chesselet, M.F,, Ed. ， (2000), 1-49页，Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey)。在细胞培养中A(3的自身结合是对神经细胞产生毒性所必须的(Pike, C. J.等人，Brain Res. 563: 311-314 (1991), Lorenzo, A.和Yankner, B.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 12243-12247 (1994), Howlett, D.R.等人， Neurodegeneration4: 23-32 (1995))。最初，人们认为原纤维形式的物质 为毒性物质。但是，在培养中用以杀死神经细胞所需的纤维状A卩的剂 量非常大(Seubert,P.等人，Nature〖伦敦)359: 325-327 (1992))。之后的 研究显示神经机能障碍和变性可能归因于较小的、可溶的A卩集合，其 被称作可溶性低聚物(淀粉状蛋白-衍生的扩散性配体，ADDLs) (Lambert, M.P.等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 6448-6453 (1998)， Hartley, D.M. 等人，J. Neu腦i. 19: 8876-8884(1999), Walsh, D.M.等人，J. Biol.Chem. 274: 25945-25952 (1999))。对于由可溶性低聚物诱导的选择性神经元变 性进行了特别阐述(Kim,H, J.等人，Faseb J. 17(1): 118-20 (2003))。本申请人开发了 一种以高产率并且在使所述可溶性低聚物保持稳 定的条件下制备可溶性低聚物的方法。专利技术概述本专利技术是一种制备稳定和可溶的AP低聚物制剂的方法及其组合物和制剂。所述方法使用高浓度的A卩肽、高于7.5的pH和多价阴离子， 例如具有二价阴离子的緩冲液，来促进A(3低聚物的制剂。在进一步的 实施方案中，所述方法还使用附加的添加剂，例如三氟乙醇和甘油来提 高低聚物的稳定性。在本专利技术的另一个实施方案中，所述方法的产物是稳定、可溶的A卩 低聚物，而且由动态光散射技术测量的粒度为10nm-100nm，分子量 (Mw)为100 kDa- 500 kDa。在本专利技术的更进一步的实施方案中，所述稳定、可溶的AP低聚物 为具有下述特性的肽制剂其中至少50%为直径为lOnm- 50nm和Mw 为100kDa- 500 kDa的低聚物形式。在本专利技术的另 一个实施方案中，所述肽制剂用于产生 一种用以治疗 阿尔茨海默氏病的治疗性抗体。附图简述附图说明图1A代表pH对可溶性Ap低聚物的形成的影响。在介于4.5和9.0 之间的不同pH值的钠緩冲液中制备A卩样品。图1B显示由动态光散射 分析法获得的AP低聚物的流体力学直径(Dh)分布，其中(O)代表质量分 数，(〃)代表散射强度分数。图2代表多价离子对可溶性A卩低聚物的形成的影响。 图3代表AP肽浓度对可溶性Ap低聚物的形成的影响。 图4代表在4。C下贮存1天和4天之后从HP-SEC柱中回收可溶性 A卩低聚物制剂。对AP峰的总面积进行积分并相对公称浓度作图。图5代表温度和各种赋型剂对可溶性AP低聚物的形成的影响。图 5A显示各种赋型剂在37。C下的影响，而图5B显示同样的赋型剂在4。C 下的影响。图6代表在磷酸钠緩冲液中甘油对可溶性AP低聚物的稳定性的影响。图7代表利用戊二醛所进行的APc和A(34o单体肽的交联。显示在 左侧的分子量标记作为对尺寸分布的估计。轨迹1-5分别含有A卩42，0%、 0.01%、 0.05%、 0.10%和0.50%的戊二醛。轨迹6-10分别含有A|340, 0%、 0.01%、 0.05%、 0.10%和0.50%的戊二醛。图8代表在50mM磷酸盐，pH 9.0的緩冲液中形成的可溶性A卩42 低聚物在4。C(2-8。C)下贮存1、 4和7天时的稳定性，其是通过对戊二醛 交联样品和非交联对照品进行SDS-PAGE分析而确定的。分子量标记物 作为对尺寸分布的估计。图8A:轨迹l,空白；轨迹2-4分別为第l、 4和7天的在50mM 磷酸盐中的lmM贮存液，0.5%戊二醛；轨迹5-7分别为第l、 4和7天 的lmM贝i存液，0%戊二醛；轨迹8， MWM, 0.5%戊二醛；轨迹9， MWM， 0%戊二醛；轨迹10-12分别为第1、 4和7天的850 pM贮存液， 0%的戊二醛。图8B:轨迹l，空白；轨迹2-4分别为第l、 4和7天的在50 mM 磷酸盐中的850 pM贮存液，0.5%戊二醛；轨迹5, MWM, 0.5%戊二醛； 轨迹6, MWM, 0%戊二醛；轨迹7-10分别为第l、 4和7天的650 贮存液，0.5%戊二醛；轨迹10-12分别为第1、 4和7天的650 贮存 液，0%戊二趁。图8C:轨迹l,空白；轨迹2-4分别为第l、 4和7天的在50mM 磷酸盐中的450 (iM贮存液，0.5%戊二醛；轨迹5-7分别为第l、 4和7 天的450 pM!)&存液，0%戊二醛；轨迹8, MWM, 0.5%戊二醛；轨迹9, MWM， 0%戊二醛；轨迹10-12分别为第1、 4和7天的250 jliM贮存液， 0%戊二醛。图8D:轨迹l，空白；轨迹2-4分別为第l、 4和7天的在50 mM 磷酸盐中的250 pM贮存液，0.5%戊二醛；轨迹5, MWM, 0.5%戊二醛； 轨迹6, MWM， 0%戊二酪；轨迹7-10分别为第l、 4和7天的100 (iM 贮存液，0.5%戊二醛；轨迹10-12分别为第1、 4和7天的100jiM贮存 液，0%戊二醛。图9代表在50 mM磷酸盐，pH 9.0的缓冲液中的A^2贮存液在4 。C下经7天后其浓度对PC-12细胞的体外生物活性的影响。填充的正方 形-5微摩尔试验浓度，开圆-1微摩尔试验浓度。专利技术详述制备可溶性Ap低聚物的标准步骤("标准方案")是在4。C下于F12培养基(pH 7.4)中在高达100 pM的浓度下将A卩肽培养过夜(Lambert, M.P.等人,Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 6448-6453 (1998)， Chro本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备稳定、可溶的淀粉状蛋白β（Ａβ）低聚物的方法，包括：（ａ）得到在有机溶剂中的Ａβ肽的浓缩贮存液；和（ｂ）将所述肽的浓缩贮存液加入到具有至少１０ｍＭ二价阴离子而且ｐＨ被缓冲至至少７．５的水溶液中，以形成最终的肽浓度超过１００μＭ的反应混合物；其中稳定、可溶的Ａβ低聚物是经放置而在步骤（ｂ）的反应混合物中形成的，而且其包含至少５０％的所述反应混合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：H马赫，D纳夫罗茨基，D蒂里奥特，R埃文斯，
申请(专利权)人：默克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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