液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：（1）样品预处理；（2）色谱‑质谱检测。发明专利技术针对鱼肉样品中的基质效应问题，结合河鲀毒素的化学特点，在前处理时加入硅藻土，并采用超低温冷冻的方式，最大程度的将毒素从肌肉组织中分离出来。样品经1%乙酸甲醇在60℃细胞破碎仪超声提取，Carbon‑GCB SPE小柱净化后，直接进样分析，节省了浓缩时间。与现有技术中0.2%乙酸水溶液提取、其它SPE净化以及超滤等方法相比，样品直接进样分析，处理过程简捷、低耗，方法准确，操作方便、重现性好。

Fast determination of tetrodotoxin content in fish by HPLC-MS

The invention discloses a method for rapid determination of fluid content in fish tetrodotoxin combined, which comprises the following steps: (1) sample pretreatment; (2) chromatography mass spectrometry. The invention is directed to the matrix effects in fish samples, combined with the characteristics of chemical tetrodotoxin, adding diatomite in the pre process, and the use of cryopreservation, the greatest degree of the toxin isolated from muscle tissue. The sample was 1% acetic acid methanol at 60 DEG C cell dissruptor ultrasonic extraction, Carbon GCB SPE column purification, sample analysis, save the time of concentration. Compared with the prior art, such as the extraction of 0.2% acetic acid aqueous solution, other SPE purification and ultrafiltration, the sample is directly injected into the sample, the processing process is simple, the consumption is low, the method is accurate, the operation is convenient, and the reproducibility is good.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，属于色谱检测

技术介绍
TTX(河鲀毒素)是发现最早而毒性极大的小分子海洋毒素，毒性为氰化钠的1000倍。毒性作用主要表现为选择性地阻遏神经和肌肉的钠离子通道，抑制钠离子通过神经细胞膜，先后麻痹感觉和运动神经，严重的脑干麻痹导致呼吸衰竭；中毒潜伏期短，致死率高达60％。TTX为无色棱柱状晶体，可溶于弱酸的水溶液。溶液pH值影响其稳定性，pH值<3和pH值>7时易分解；温度高于220℃时炭化。TTX的测定方法主要有酶联免疫法、生物检测法(小鼠法)、电化学法(毛细管电泳法)、色谱法(液相色谱、液相色谱-质谱、气相色谱-质谱联用)等。但小鼠法测定的准确度会因小鼠个体差异而变化；酶联免疫法成本较高，气相色谱-质谱与液相色谱-荧光法需将TTX经碱解衍生后再检测，衍生效率以及源自样品的荧光物质会干扰检测结果，且步骤复杂、费时。而液相色谱-质谱联用，前处理净化需达到质谱进样要求，提取溶液一般采用三氯乙酸、乙酸等水溶液，净化样品采用过C18小柱、离子交换柱等以及超滤等手段，但所得提取液仍因存在严重的基质效应而影响方法灵敏度。
技术实现思路
针对现有技术中的基质效应问题，在现有检测技术的基础上，针对不同的鱼类提取器官，本专利技术重点改进了其前处理的方法，同时提供一种新的液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：(1)样品预处理活鱼冷冻处死，去皮，取其肌肉部分50g，加入肌肉重量10-20％的硅藻土，经均质制样机充分粉碎，均质粉碎20-25min，然后放入-80℃冰箱中冷冻2-3h。冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入2-3g氯化钙和1.0％乙酸甲醇溶液5-10mL，均质30-100s，用细胞破碎仪在60℃超声提取20-40min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用3mL的1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min离心5min，所得上清液待净化；取1.0mL上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min,弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定。(2)色谱-质谱条件1.色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)；洗脱程序为：0-5min，从20％线性递增到95％；5-7min，7-7.01min从95％线性递减至20％；7.01-12min，平衡6min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃；TTX的液相色谱梯度洗脱条件时间(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.03509557.03509557.01350208012.035020802.质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.06，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见下表：TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量*定量离子对。优选的，在(1)样品预处理的粉碎过程中加入硅藻土的同时，加入10mL0.1mol/L盐酸溶液。本专利技术的有益效果：本专利技术针对鱼肉样品中的基质效应问题，结合河鲀毒素的化学特点，在前处理时加入硅藻土，并采用超低温冷冻的方式，最大程度的将毒素从肌肉中分离出来。样品经1％乙酸甲醇在60℃细胞破碎仪超声提取，Carbon-GCBSPE小柱净化后，直接进样分析，节省了浓缩时间。与现有技术中0.2％乙酸水溶液提取、其它SPE净化以及超滤等方法相比，样品直接进样分析，处理过程简捷、低耗，方法准确，操作方便、重现性好。该方法操作简单、准确度高、成本低、省时高效，改进了基质效应问题，与现有技术相比，回收率得到提高。且具有灵敏度高、重现性好、结果可靠的优点，满足目前快速检测鱼肉产品中TTX含量的技术要求。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1是阳性河鲀鱼肉样品中TTX总离子流图。图2是空白的红鳍东方鲀肉样品的总离子流图。图3是加标10μg/kg的红鳍东方鲀肉样品的总离子流图。具体实施方式实施例1本实施例提供的液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：(1)样品预处理活鱼冷冻处死，去皮，取其肌肉部分50g，加入肌肉重量18％的硅藻土，加入10mL0.1mol/L盐酸溶液，经均质制样机充分粉碎，均质粉碎23min，然后放入-80℃冰箱中冷冻3h。冷冻结束后称取试样1.00g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入3g氯化钙和1.0％乙酸甲醇溶液8mL，均质60s，用细胞破碎仪在60℃超声提取30min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用3mL的1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min离心5min，所得上清液待净化；取1.0mL上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min,弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定。(2)色谱-质谱条件1.色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)；洗脱程序为：0-5min，从20％线性递增到95％；5-7min，7-7.01min从95％线性递减至20％；7.01-12min，平衡6min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃；TTX的液相色谱梯度洗脱条件时间(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.03509557.03509557.01350208012.035020802.质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.06，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见下表：TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量*定量离子对。如图1，是阳性河鲀鱼肉样品中TTX总离子流图。实施例2线性范围与检出限本文档来自技高网...

【技术保护点】
液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)样品预处理活鱼冷冻处死，去皮，取其肌肉部分50g，加入肌肉重量10‑20％的硅藻土，经均质制样机充分粉碎，均质粉碎20‑25min，然后放入‑80℃冰箱中冷冻2‑3h；冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入2‑3g氯化钙和1.0％乙酸甲醇溶液5‑10mL，均质30‑100s，用细胞破碎仪在60℃超声提取20‑40min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用3mL的1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10 000r/min离心5min，所得上清液待净化；取1.0mL上清液过Carbon‑GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min,弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯‑尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC‑MS/MS测定；(2)色谱‑质谱条件1.色谱条件色谱柱：Zic‑Hilic(100mm×2.1mm i.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)；洗脱程序为：0‑5min，从20％线性递增到95％；5‑7min，7‑7.01min从95％线性递减至20％；7.01‑12min，平衡6min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃；TTX的液相色谱梯度洗脱条件时间(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.03509557.03509557.01350208012.035020802.质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.06，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见下表：TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量*定量离子对。...

【技术特征摘要】
1.液质联用快速测定鱼肉中河鲀毒素含量的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)样品预处理活鱼冷冻处死，去皮，取其肌肉部分50g，加入肌肉重量10-20％的硅藻土，经均质制样机充分粉碎，均质粉碎20-25min，然后放入-80℃冰箱中冷冻2-3h；冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入2-3g氯化钙和1.0％乙酸甲醇溶液5-10mL，均质30-100s，用细胞破碎仪在60℃超声提取20-40min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；残渣用3mL的1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min离心5min，所得上清液待净化；取1.0mL上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min,弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定；(2)色谱-质谱条件1.色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文卿，吴振兴，王曼霞，静平，田娟，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37