本发明专利技术公开了一种黑青斑河鲀干扰素IFNγ1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，编码基因的制备方法，是用引物序列SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物克隆得到干扰素蛋白IFNγ1的编码基因；同时还公开了干扰素蛋白IFNγ1的制备方法，是将黑青斑河鲀IFNγ1的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ1。本发明专利技术的黑青斑河鲀干扰素IFNγ1可以用于制备鱼类免疫调节添加剂或免疫佐剂，具有诱导鱼类免疫基因表达的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种黑青斑河飩II型干扰素IFNy 1的编码基因、蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞免疫因子Y干扰素(IFN Y)，作为干扰素系统中重要的II型IFN，是主要的巨噬细胞刺激因子和调控免疫反应的关键信号分子，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞 (NK)和巨噬细胞活性，促进免疫球蛋白的转换，具有抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用。干扰素IFNyI和IFNY2基因是鱼类IFNY基因的两个亚型，其氨基酸序列的特征是含有两个保守结构，包括氨基酸序列中的6个α-螺旋和在靠近其氨基酸序列C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]这个保守结构，这与已研究过的其他区中的IFNy 二级结构类似。IFNY具有广泛的生物学活性。目前已知干扰素作为细胞因子的重要类型，是细胞和机体受到病毒感染或受核酸、细菌内毒素等诱导时，由受体细胞分泌的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，能诱导细胞进入抗病毒状态。IFNy是由Thl细胞产生的细胞因子。 它主要通过与其受体结合，活化JAK-STAT信号通路，激活下游基因的转录，包括相关转录因子和免疫分子，如STATl、IRFl、ICSBP和MHC II等，从而诱导巨噬细胞产生毒性物质消灭胞内细菌，诱导宿主内一些抗病毒蛋白的合成，调节T细胞的增殖和分化以及增强抗原提呈作用，达到保护宿主的目的。IFNy抗病毒机理主要是能提高细胞表面MHC类分子表达，有助于向细胞毒性T 细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，此外还可以通过下游基因的转录及抗病毒效应基因表达而达到抗病毒作用。对于表达MHC I类抗原的细胞，IFN γ可以诱导I类抗原以更高的水平表达；对于无法检测到的I类抗原基本表达水平的细胞，IFNy也可以诱导I类抗原的表达，且一般比I型干扰素IFNa/β具有更强的作用。在体注射IFNY可以导致许多组织中I类抗原表达水平的广泛增高。IFNy对MHC II类分子表达的调节作用MHC II类分子仅存在于专职的抗原呈递细胞(如树突状细胞及B细胞)，其他细胞中MHC II类分子均可由IFNy 诱导产生。II类抗原呈递途径的所有关键基因的正常表达都是必需的，它们受一个单一的受IFNy诱导的转录因子II类反式激活蛋白(c II TA)的调节。IFNy能够激活吞噬细胞的杀菌活性。活化的巨噬细胞表现最突出的是对许多细胞内的和吞噬的生物体如分支杆菌、刚地弓形虫、锥虫和利什曼原虫的杀菌活性大大增强。与哺乳动物相似，鱼类IFN γ重组蛋白能够影响刺激免疫细胞的增殖，增加IFN γ 自身的基因表达，以及诱导下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表达。Mx是IFN系统中熟为人知的抗病毒蛋白，作为一种GTP酶，它主要通过干扰病毒的聚合酶来抑制RNA的复制， 从而发挥抗病毒的作用。它主要受I型IFN诱导大量表达发挥其作用，II型IFN对其有一定的诱导作用。重组的IFNy可影响鱼类的细胞免疫反应。初步研究的结果表明，一定浓度的重组虹鳟IFNy在RTS-Il cells中会促进下游免疫基因IPlO和MHC II β的表达。近年来鱼类病害发生频繁，其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性的危害，这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。IFNy由于其抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用在哺乳动物中的应用已非常广泛，对人的临床应用治疗疾病方面也已很普遍。而其在鱼类的研究与应用才开始起步，可以预测其具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术鱼类免疫防治中没有干扰素蛋白IFNY的缺陷， 提供一种黑青斑河飩干扰素IFNy 1。本专利技术的另一目的是提供黑青斑河飩干扰素ifny 1的编码基因。本专利技术的又一目的是提供黑青斑河飩干扰素IFNY 1的制备方法。本专利技术的再一目的是提供黑青斑河飩干扰素IFN y 1的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种黑青斑河飩干扰素IFN γ 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，共179个氨基酸； 等电点为7. 882，分子量为20. 18千道尔顿。黑青斑河飩干扰素IFN γ 1氨基酸编码序列含有一段N段信号肽序列，使用Jpred方法预测其蛋白的二级结构，发现它含有6个α-螺旋结构，且在靠近其氨基酸序列C端的F螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[ IV] 这个保守结构，这与其他已鉴定的IFNy —样。此外，对干扰素IFNYI进行糖基化位点的预测发现其含有一个糖基化位点。同时，通过对氨基酸序列的C末端进行分析，发现在黑青斑河飩干扰素IFNyI氨基酸序列的C末端没有类似核定位序列(NLS)的RRRR 序列。上述黑青斑河飩干扰素ifn y 1的编码基因，其核苷酸序列如seq id no: 2所示。上述黑青斑河飩干扰素IFNy 1的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河飩总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO: 3为引物，进行反转录，得到cDNA ； 再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID NO: 5，进行PCR，得到黑青斑河飩干扰素IFNy 1的编码基因。黑青斑河飩干扰素ifny 1可以通过表达载体在大肠杆菌中以胞内不溶的形式表达，具体制备方法是将黑青斑河飩干扰素IFNy 1的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化至大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河飩干扰素IFNy 1。所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET32a，重组表达质粒的构建包括以下步骤以含黑青斑河飩干扰素IFNyI编码基因的质粒为模板，设计含有I酶切位点的上游引物SEQ ID N0:6，含历idIII酶切位点的下游引物SEQ ID N0:7进行PCR，PCR产物克隆到原核融合表达载体pET32a上，得到重组表达质粒，该质粒含有6 XHis亲和标记位点。该表达载体是以T7为启动子，获得的蛋白的C端有6XHis结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所述培养转化的大肠杆菌的培养条件为接单菌落至含氨苄青霉素lb液体培养基中，37°C，250 rpm，振荡培养过夜，按1: 50体积比接种到200 ml 37°C预热的含氨苄青霉素TB液体培养基中，37 °C，250 rpm，培养至0D600达到0. 6。大肠杆菌优选BL21 (DE3)。 所述诱导为加入IPTG至终浓度为0. 3mmol/L，经诱导后收集菌体。诱导时间优选为7小时，可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量。所述纯化是将总菌体用Bug Buster Master Mix混勻重悬，收菌后可以免除细胞破碎，室温下将重悬的细胞液孵育10-20min ；(孵育后获得的抽提物不是粘稠的)4°C下 16，OOOg离心20 min以去除不溶的细胞碎片，沉淀重悬于Bug Buster Master Mix，吸打涡旋，重悬沉淀，涡旋1 min ;4°C，5，000g离心15 min，移去上清，收集沉淀，沉淀即包涵体； 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的Bug Buster Master Mix中， 涡旋混本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种黑青斑河鲀干扰素ＩＦＮγ１，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
1.一种黑青斑河飩干扰素IFNY 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2.权利要求1所述黑青斑河飩干扰素IFNy1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。3.权利要求2所述黑青斑河飩干扰素IFNγ 1的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河飩总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3为引物，进行反转录，得到cDNA ；再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID N0:5，进行PCR， 得到权利要求2所述黑青斑河飩干扰素IFN γ 1的编码基因。4.权利要求1所述黑青斑河飩干扰素IFNYl的制备方法，是将黑青斑河飩干扰素 IFNyl的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化至大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河飩干扰素IFNy 1。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述表达载体为大肠杆菌表达载体 pET32a，重组表达质粒的构建包括以下步骤以含黑青斑河飩干扰素IFNy 1编码基因的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID N0:6，下游引物SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢丹琪，张旭，贝锦新，陈洁琳，易诗白，冷婷婷，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81
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