复合重金属胁迫下贻贝DNA损伤的检测方法技术

本发明专利技术属于生态基因毒理学研究领域，具体涉及一种复合重金属胁迫下贻贝DNA损伤的检测方法，具体包括以下步骤：贻贝培养、血细胞样品提取、细胞存活率测定、复合体外暴露和DNA损伤的测定，其中复合体外暴露步骤中加入重金属溶液为Cu、Cd和Pb中的一种或多种，混合均匀后4℃黑暗条件下暴露60min。DNA损伤的测定步骤包括离心处理、细胞包埋、细胞裂解、电泳、中和、观察计数和数据分析等。本发明专利技术可以准确反映多种重金属复合污染对贻贝DNA的损害的情况。

Method for detecting DNA damage of mussel under compound heavy metal stress

The invention belongs to the field of ecological gene toxicology research, particularly relates to a method for detecting heavy metal stress under mussel DNA damage, including the following steps: mussel culture, blood sample extraction, cell survival rate determination, determination of damage in composite in vitro exposure and DNA, the composite in vitro exposure step by adding heavy metal solution into one or a variety of Cu, Cd and Pb, after mixing 4 DEG C under dark exposure 60min. The measurement procedures of DNA damage include centrifugation, cell embedding, cell lysis, electrophoresis, neutralization, observation and counting, and data analysis. The invention can accurately reflect the damage situation of multiple heavy metal compound pollution to mussel DNA.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生态基因毒理学研究领域，具体涉及一种体外条件下复合重金属胁迫导致的贻贝血细胞DNA损伤的检测方法。
技术介绍
随着工业化和城市化进程的加快，重金属污染问题日益严重，环境中的重金属通过河水、降雨等过程将转移至海洋环境中，这些环境重金属通过食物链和食物网在生物体内蓄积并持久存在，对生物和生态环境带来严重威胁。紫贻贝（Mytilusgalloprovincialis）是我国东海地区最常见的经济贝类，因为其具有分布广泛、固着性、滤食性及蓄积性的特点，被广泛应用于毒理学研究。使用贻贝作为模式生物，采用体外实验的方法，模拟环境中重金属水平测定贻贝血细胞的DNA损伤水平，从而判断重金属对于海洋生物的胁迫压力。DNA损伤的测定可以使用单细胞凝胶电泳的方法，又称彗星实验，是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法，具有简便、快捷、高效、用量小等优点。但目前实验室研究多采用体内实验的方法，集中研究某一单一重金属对生物体的胁迫作用，不能够及时准确反映现实环境中多种重金属复合污染对生物体细胞的损害情况，而且检测耗时较长，难以应用于现场检测。目前已有的彗星实验方法在检测的过程中常会发生琼脂糖凝胶破碎、脱胶，细胞附着型和重悬分散性较差的情况，而且较短链的DNA片段断裂较难通过彗星实验呈现，因此应用彗星实验的方法开展的检测准确度受到一定程度的限制。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够检测复合重金属胁迫下贻贝单个血淋巴细胞中DNA损伤的快速检测方法，该方法不仅可以准确反映多种重金属复合污染对贻贝血细胞DNA的损害的情况，还可以准确呈现污染物造成的单链DNA片段的断裂。更重要的是，在检测的过程中，为了满足检测的准确性，可以有效的避免下层琼脂糖凝胶的破碎和脱落。本专利技术所制备的上层凝胶，不但可以保证有效的与下层凝胶附着，而且所包埋的血细胞能够很好的分散其中，确保可以检测到单细胞水平。同时，本项技术利用分离出的血细胞进行体外实验，不影响实验动物的生命健康，不仅缩短了实验时间，降低了实验成本，而且避免采用生物样品可能带来的伦理学问题，有利于动物保护。再次，本专利技术可以应用于现场快速血细胞样品采集、检测，速度较快而且不会因为生物样品的大量采集而影响当地的生态平衡。最后，贻贝血细胞具有较高响应环境变化，尤其是污染物胁迫压力下的敏感性，该专利技术的使用可以实现对于重金属所导致的海洋生物安全威胁以及海洋生态环境恶化的预警作用，应用前景广阔。为解决上述技术问题，本专利技术包括以下步骤：（1）血细胞样品提取：从贻贝闭壳肌中抽取血淋巴液于离心管中进行离心处理，离心条件：温度4℃，转速2000~10000rpm，时间2~10min；离心后去除上清液，所得下层沉淀物即为血细胞样品，将所得血细胞样品置于-4~4℃条件下保存备用；（2）细胞存活率测定：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4%（v/v）的台盼蓝染料，静置3~10min；将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；若细胞存活率高于90%且细胞数量为107，则进行暴露实验；否则，则返回步骤（1），重新提取血细胞样品或对细胞样品进行稀释；（3）复合体外暴露：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积的多种重金属的混合溶液，混合均匀后4℃黑暗条件下暴露60min；（4）DNA损伤的测定：a．将经步骤（3）中所得血细胞样品离心处理，离心条件如步骤（1）所述，离心后，去除上清液得到沉淀细胞团；b．细胞包埋：将浓度为0.5%~1.5%的正常熔点琼脂糖，微波加热溶解后，涂覆在载玻片上，放置过夜后备用；将浓度为0.5%~1.0%低熔点琼脂糖加热充分溶解后置于37℃水浴中保温备用；用磷酸缓冲溶液或HBSS平衡盐溶液重悬步骤a中所得沉淀细胞团，再次离心，去除上清液，离心条件如步骤（1）所述；将步骤处理后的低熔点琼脂糖加入步骤中处理后的沉淀细胞团，混合均匀后滴加在步骤中所制得载玻片上，盖上盖玻片，置于4℃黑暗条件下固定30~60min；c．细胞裂解：储备液制备：2.5MNaCl，100mMEDTA和10mMTrisbase混合溶解，加入NaOH调节pH值为10，置于4℃环境中保存备用；工作液制备：50ml储备液中加入0.5ml曲拉通X-100和5ml二甲基亚砜，即得工作液；裂解过程：取下步骤b中的盖玻片后，将载玻片浸入染色缸内的工作液中，在4℃黑暗条件下裂解20~60min；d．电泳：电泳液制备：0.3MNaOH和1mMEDTA溶解于纯水中，调节pH≥13，置于4℃环境中保存备用；解旋过程：将步骤c中裂解后的载玻片放置于水平电泳槽中，加入电泳液，在4℃黑暗条件下解旋20~40min；电泳过程:打开电泳仪，采用稳压电流在4℃黑暗条件下电泳20~40min；e．中和:步骤d中电泳后的载玻片用中性缓冲溶液在4℃条件下反复冲洗；f．观察计数，数据分析。进一步的，所述步骤（1）中的离心条件如下：温度为4℃，转速为10000rpm，时间为2min。进一步的，所述步骤（3）中重金属溶液有三类，第一类为Cu、Cd、Pb纯溶液，第二类为Cu+Cd、Cd+Pb、Pb+Cu复合溶液，第三类为Cu+Cd+Pb复合溶液。进一步的，所述步骤（4）b细胞包埋：将浓度为1.5%的正常熔点琼脂糖，微波加热溶解后，涂覆在载玻片的其中一面，放置过夜后备用；将浓度为0.75%低熔点琼脂糖加热溶解后置于37℃水浴中保温备用；用pH为7.4的磷酸缓冲溶液重悬步骤a中所得沉淀细胞团，再次离心，去除上清液，离心条件如步骤（1）所述；将步骤处理后的低熔点琼脂糖加入步骤中处理后的沉淀细胞团，混合均匀后将含有细胞的80ul低熔点琼脂糖滴加在步骤中涂覆有正常熔点琼脂糖的载玻片上，盖上盖玻片，置于4℃黑暗条件下固定60min。进一步的，所述步骤（4）d中解旋过程：将裂解后的载玻片按列有序排列放置于水平电泳槽中，每列排满，加入电泳液，在4℃黑暗条件下解旋20min。进一步的，所述步骤（4）e步骤如下：将步骤d所得电泳后的载玻片用中性缓冲溶液在4℃条件下反复冲洗3次，每次10min。进一步的，所述步骤（1）中利用移液枪吸取去除上清液。进一步的，所述步骤（4）中重悬过程均采用移液枪吹打的处理方法。进一步的，步骤e中所述中性缓冲溶液的配制方法为：将48.44gTrisbase加入1L水中，充分溶解后再调节pH为7.5。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术利用血细胞进行体外实验，代替传统的利用整个贻贝个体进行的体内实验，可有效节约时间，降低实验成本，且不会对所采用贻贝造成致命损伤，有利于动物保护。（2）本专利技术增加复合体外暴露步骤，将血细胞分别暴露在单一重金属溶液和复合重金属混合溶液中，不仅可以对单一重金属胁迫下贻贝血细胞DNA损伤进行检测，还可研究复合重金属胁迫下贻贝血细胞DNA损伤的情况，可有效模拟现实环境中重金属复合污染状况，有效提高实验效率及实验准确性。（3）本专利技术的细胞包埋步骤中采用了两层琼脂糖（下层为1.5%的正常熔点琼脂糖，上层为0.75%的低熔点琼脂糖），并改变两层琼脂糖凝胶的制备时间（提前制备与新鲜制备）有利于增强两层琼脂糖之间的本文档来自技高网...

【技术保护点】
复合重金属胁迫下贻贝DNA损伤的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）血细胞样品提取：从贻贝闭壳肌中抽取血淋巴液于离心管中进行离心处理，离心条件：温度4℃，转速2000~10000rpm，时间2~10min；离心后去除上清液，所得下层沉淀物即为血细胞样品，将所得血细胞样品置于‑4~4℃条件下保存备用；（2）细胞存活率测定：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4%（v/v）的台盼蓝染料，静置3~10min；将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；若细胞存活率高于90%且细胞数量为107，则进行暴露实验；否则，则返回步骤（1），重新提取血细胞样品或对细胞样品进行稀释；（3）复合体外暴露：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积的多种重金属的混合溶液，混合均匀后4℃黑暗条件下暴露60min；（4）DNA损伤的测定：a．将经步骤（3）中所得血细胞样品离心处理，离心条件如步骤（1）所述，离心后，去除上清液得到沉淀细胞团；b．细胞包埋：将浓度为0.5%~1.5%的正常熔点琼脂糖，微波加热溶解后，涂覆在载玻片上，放置过夜后备用；将浓度为0.5%~1.0%低熔点琼脂糖加热充分溶解后置于37℃水浴中保温备用；用磷酸缓冲溶液或HBSS平衡盐溶液重悬步骤a中所得沉淀细胞团，再次离心，去除上清液，离心条件如步骤（1）所述；将步骤处理后的低熔点琼脂糖加入步骤中处理后的沉淀细胞团，混合均匀后滴加在步骤中所制得载玻片上，盖上盖玻片，置于4℃黑暗条件下固定30~60min；c．细胞裂解：储备液制备：2.5M NaCl，100mM EDTA和10mM Tris base混合溶解，加入NaOH调节pH值为10，置于4℃环境中保存备用；工作液制备：50ml储备液中加入0.5ml曲拉通X‑100和5ml二甲基亚砜，即得工作液；裂解过程：取下步骤b中的盖玻片后，将载玻片浸入染色缸内的工作液中，在4℃黑暗条件下裂解20~60min；d．电泳：电泳液制备：0.3M NaOH和1mM EDTA溶解于纯水中，调节pH≥13，置于4℃环境中保存备用；解旋过程：将步骤c中裂解后的载玻片放置于水平电泳槽中，加入电泳液，在4℃黑暗条件下解旋20~40min；电泳过程: 打开电泳仪，采用稳压电流在4℃黑暗条件下电泳20~40min；e．中和:步骤d中电泳后的载玻片用中性缓冲溶液在4℃条件下反复冲洗；f．观察计数，数据分析。...

【技术特征摘要】
1.复合重金属胁迫下贻贝DNA损伤的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）血细胞样品提取：从贻贝闭壳肌中抽取血淋巴液于离心管中进行离心处理，离心条件：温度4℃，转速2000~10000rpm，时间2~10min；离心后去除上清液，所得下层沉淀物即为血细胞样品，将所得血细胞样品置于-4~4℃条件下保存备用；（2）细胞存活率测定：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4%（v/v）的台盼蓝染料，静置3~10min；将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；若细胞存活率高于90%且细胞数量为107，则进行暴露实验；否则，则返回步骤（1），重新提取血细胞样品或对细胞样品进行稀释；（3）复合体外暴露：取一定体积步骤（1）中所得血细胞样品于离心管中，加入等体积的多种重金属的混合溶液，混合均匀后4℃黑暗条件下暴露60min；（4）DNA损伤的测定：a．将经步骤（3）中所得血细胞样品离心处理，离心条件如步骤（1）所述，离心后，去除上清液得到沉淀细胞团；b．细胞包埋：将浓度为0.5%~1.5%的正常熔点琼脂糖，微波加热溶解后，涂覆在载玻片上，放置过夜后备用；将浓度为0.5%~1.0%低熔点琼脂糖加热充分溶解后置于37℃水浴中保温备用；用磷酸缓冲溶液或HBSS平衡盐溶液重悬步骤a中所得沉淀细胞团，再次离心，去除上清液，离心条件如步骤（1）所述；将步骤处理后的低熔点琼脂糖加入步骤中处理后的沉淀细胞团，混合均匀后滴加在步骤中所制得载玻片上，盖上盖玻片，置于4℃黑暗条件下固定30~60min；c．细胞裂解：储备液制备：2.5MNaCl，100mMEDTA和10mMTrisbase混合溶解，加入NaOH调节pH值为10，置于4℃环境中保存备用；工作液制备：50ml储备液中加入0.5ml曲拉通X-100和5ml二甲基亚砜，即得工作液；裂解过程：取下步骤b中的盖玻片后，将载玻片浸入染色缸内的工作液中，在4℃黑暗条件下裂解20~60min；d．电泳：电泳液制备：0.3MNaOH和1mMEDTA溶解于纯水中，调节pH≥13，置于4℃环境中保存备用；解旋过程：将步骤c中裂解后的载玻片放置于水平电泳槽中，加入电泳液，在4℃黑暗条件下解旋20~40min；电泳过...

【专利技术属性】
技术研发人员：邸雅楠，张翼飞，陈思雨，曲梦杰，丁家玮，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33