SIRT6的调节物及其筛选分析制造技术

一种鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法，其中在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将含有酰基‑赖氨酸部分和指示物部分的脂肪‑酰基化底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触，其中所述酰基是疏水性脂肪酰基基团，其含有至少三个通过碳‑碳键连接的碳原子的烃基；将所述去酰基化的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸与指示物部分之间的连接以产生可检测的信号；且由此关联定量的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶的活性。本申请还描述了Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节化合物，及其药物组合物，通过给予所述调节化合物的治疗方法，以及实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201180068116.3、申请日为2011年12月21日、专利技术名称为“SIRT6的调节物及其筛选分析”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2011/066480的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年12月22日，申请号为61/426,231的美国临时专利申请的优先权。关于联邦政府资助研究的声明本申请是在美国国立卫生研究院提供的合同号为GM086703的政府资助下进行。政府对本申请享有一定权利。专利技术背景去乙酰化酶(Sirtuin)是一类称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性去乙酰基酶的酶。人类有七种sirtuin，Sirt1-7，其调控多种生物学过程，包括衰老、转录和代谢。因此，能够调节sirtuin活性的小分子可以用于治疗若干人类疾病。在这七种人类sirtuin中，Sirt6特别重要，因为其作用为调控代谢和基因组的稳定性。Sirt6的生物学功能使其有望成为治疗脂肪肝疾病、肥胖症和糖尿病的靶点。因而，能够活化、抑制或以其他方式调节Sirt6的小分子将在治疗此类疾病和状况中非常有益。疟疾寄生虫恶性疟原虫含有两个sirtuin，PfSir2a和PfSir2b。已知这些sirtuin调控致病基因的表达、抗原变异和抗原基因的表达，其有助于疟疾寄生虫逃避宿主免疫系统的检测。因而，能够抑制或以其他有益方式调节这些sirtuin的小分子能够用于治疗疟疾，这也将是非常有益的。Sirt6和PfSir2a抑制物的研发受到缺乏对Sirt6和PfSir2a有效的活性分析特别是能够用于高通量筛选的方法的阻碍。研发有效的Sirt6和PfSir2a活性分析的这种困难主要是由Sirt6和PfSir2a的去乙酰基酶活性非常弱造成的。在这七种哺乳动物sirtuin中，Sirtuin4-7具有较弱的或不具有去乙酰基酶活性。已知Sirt6的功能为是组蛋白H3K9-和H3K56-特异性去乙酰基酶，因为其他酰基肽不能被Sirt6水解。然而，去乙酰基酶的活性非常弱，迄今为止尚无kcat和Km检测的报告。类似地，已知PfSir2a的去乙酰基酶活性比人Sirt1弱得多。专利技术简述本申请发现了当赖氨酸上的酰基基本上是疏水的，特别是当酰基含有较高碳原子数(例如，至少5、6、7、8、9、10或更高的碳原子数)的烃基如长链烷基或烯基时，Sirt6是酰基-赖氨酸残基的选择性去酰基酶。Sirt6的这种选择性活性与已知的其他sirtuin的选择性形成鲜明对比。例如，Sirtuin1、2和3已知具有强劲的去乙酰酶活性，而Sirtuin5已知能够容易地从赖氨酸残基上除去丙二酰基、琥珀酰基和戊二酰基。相反地，本申请发现了与其去乙酰基酶活性相比，Sirt6明显能够更加有效地(例如，有效性超过30倍以上)从赖氨酸残基上除去长链疏水性脂肪酰基。与Sirt6类似，人们发现PfSir2a和Sir7的去乙酰基酶活性也非常弱，但其能够更高效地除去长链脂肪酰基。利用Sirt6这种新发现的活性，本申请描述了一种方法，该方法能够在不同条件下和存在任意多种可能的Sirt6调节物的情况下，有效测定Sirt6(和具有类似活性的sirtuin，如PfSir2a和Sirt7)的活性水平。因此，尽管通过观察去酰基酶的活性几乎无法测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性水平或鉴定其调节物(即，调控物，包括活化物或抑制物)，但是本申请已发现了一种通过引入含有长链脂肪酰赖氨酸结构的底物测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活化水平或鉴定其调节物(即，调控物，包括活化物或抑制物)以及测定不同条件下Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-介导酰基水解的效能的有效方法。本申请描述的方法还能有利地用于对能够调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的小分子进行高通量筛选。通过本申请描述的方法鉴定的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-特异性调节物能够用于治疗或预防多种以Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性异常或处于非最佳状态为特征的多种疾病。这些疾病包括与代谢(例如，肥胖症)、糖尿病、疟疾和基因组稳定性相关的那些疾病。本申请还发现哺乳动物的组蛋白具有长链脂肪酰基赖氨酸修饰，Sirt6的生理学作用可能是除去这些脂肪酰基修饰。因此，Sirt6可能能够通过除去组蛋白上的修饰来调控某些基因的转录，这提示了组蛋白赖氨酸长链脂肪酰化是参与转录调控的新型表观遗传学修饰。尽管短链脂肪酰修饰如乙酰化能够调控转录是公知的，但是长链脂肪酰化如在组蛋白上的豆蔻酰化参与表观遗传学修饰迄今为止仍是未知的。由于转录调控对正常和病变细胞均很重要，因而所述的新型表观遗传学修饰能够有针对性地治疗多种疾病。更具体地，用于鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法(即，分析)包括：(i)在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将酰基化的底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基-赖氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三个、四个或五个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代，以及其中所述赖氨酸的侧链ε-氨基丁基基团可以衍生化；(ii)将去酰基的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分之间的连接以释放所述指示物部分并产生具有信号强度的可检测信号；以及(iii)将所述信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相关联；其中通过存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相对于不存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的变化，将所述候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物。候选化合物可以是在上文所述的分析中检测的任意化学物质(例如，分子或大分子，如蛋白或核酸)。依据分析结果，可以确定候选化合物是否是Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物(例如，抑制物或活化物)。在特定实施方式中，候选化合物或调节物具有下述化学结构：在上述式(1)中，R1是具有至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个通过碳-碳键连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法，所述方法包括：在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将酰基化的底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含有酰基‑赖氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三个通过碳‑碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳‑碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代，以及其中所述赖氨酸的侧链ε‑氨基丁基基团可以衍生化；将去酰基的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分之间的连接以释放所述指示物部分并产生具有信号强度的可检测信号；以及将所述信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相关联；其中通过存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相对于不存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的变化，将所述候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物；其中所述酰基化的底物具有下述化学结构：其中R7是具有至少五个通过碳‑碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳‑碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；R8选自S、NR13和O，其中R13是氢原子或烃基R；X4、X5和X6独立地选自‑(CH2)n‑、‑NR14‑、‑O‑、‑S‑或键，其中R14是氢原子或烃基R，以及其中n表示1、2或3；R11是氢原子或烃基R；R9和R10独立地为氢原子或烃基R，其中R10还可以是OH或SH，以及其中R9和R10中的至少一个是指示物部分；其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代。...

【技术特征摘要】
2010.12.22 US 61/426,2311.一种鉴定Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性调节物的方法，所述方法包括：
在Sirt6、PfSir2a或Sirt7使底物去酰基的条件下，在存在候选化合物的情况下将酰
基化的底物与Sirt6、PfSir2a或Sirt7接触以提供去酰基的底物，其中所述酰基化的底物含
有酰基-赖氨酸部分和指示物部分，所述酰基含有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃
基，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的
碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不
包括在内，并且其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代，以及其中所
述赖氨酸的侧链ε-氨基丁基基团可以衍生化；
将去酰基的底物与裂解试剂接触，所述裂解试剂裂解所述赖氨酸和指示物部分之间
的连接以释放所述指示物部分并产生具有信号强度的可检测信号；以及
将所述信号强度与Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相关联；
其中通过存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性相对
于不存在所述候选化合物的条件下的Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的变化，将所述
候选化合物鉴定为Sirt6、PfSir2a或Sirt7去酰基酶活性的调节物；
其中所述酰基化的底物具有下述化学结构：
其中R7是具有至少五个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个
选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳
原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，以及其中在所述烃基
中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；
R8选自S、NR13和O，其中R13是氢原子或烃基R；
X4、X5和X6独立地选自-(CH2)n-、-NR14-、-O-、-S-或键，其中R14是氢原子或烃基R，
以及其中n表示1、2或3；
R11是氢原子或烃基R；
R9和R10独立地为氢原子或烃基R，其中R10还可以是OH或SH，以及其中R9和R10中
的至少一个是指示物部分；
其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或
含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酰基-赖氨酸部分连接至至少一个其他的氨
基酸，以及所述指示物部分通过肽键共价连接至所述赖氨酸或至少一个其他的氨基酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述裂解试剂是蛋白水解酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述指示物部分是荧光团。
5.根据权利要求4所述的方法，其中由于所述荧光团的裂解和释放，所述荧光团改变
其发射波长。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述候选化合物具有下述化学结构：
其中R1是具有至少三个通过碳-碳键连接的碳原子的烃基，其中所述烃基任选地包括一个
选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳
原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式的不包括在内，并且其中在所述烃基
中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代；
R2选自S、NR6和O，其中R6是氢原子或烃基R；
X1、X2和X3独立地选自-(CH2)n-、-NR12-、-O-、-S-或键，其中R12是氢原子或烃基R，
以及其中n表示1、2或3；
R5是氢原子或烃基R；
R3和R4独立地是氢原子或烃基R；
其中所述烃基R独立地为未取代的或者被一个或多个选自N、O、S、P和F的杂原子或
含有一个或多个所述杂原子的杂原子基团所取代，其中R4可以是OH或SH。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少三个通过碳-碳键连接的
碳原子且不存在杂原子取代，但是一个或多个氢原子任选地被氟原子所取代。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少6个通过碳-碳键连接的
碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃
基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式
的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少7个通过碳-碳键连接的
碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，所述杂原子打断所述烃
基的碳-碳键或者取代所述烃基中的碳原子，但是所述杂原子为OH、SH或NH2基团形式
的不包括在内，以及其中在所述烃基中的一个或多个氢原子任选地被氟原子取代。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述R1的烃基具有至少8个通过碳-碳键连接的
碳原子，其中所述烃基任选地包括一个选自O、N和S的杂原子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林合宁，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：美国;US