一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法技术

本发明专利技术公开一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，是一种基于荧光示踪技术的水生生物体内微塑料定量检测方法，属于环境污染物检测领域。其步骤为：选择受试荧光微塑料和模式水生生物进行染毒实验；采集目标组织样品；硝酸消解组织，得到的消解液定容；配制不同浓度梯度的荧光微塑料悬浊溶液，根据荧光光谱仪测定的荧光值得到标准曲线；测定样品溶液的荧光值，基于标准曲线得到相应组织样品中微塑料含量。本发明专利技术技术方案能有效对摄入水生生物体内的微塑料进行准确定量，达到检测微塑料在生物体内的富集和分布的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境污染物检测领域，具体来说是一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，是一种基于荧光示踪技术的微塑料颗粒定量检测方法。
技术介绍
塑料因其高稳定性、持久性和耐腐蚀性得到广泛使用，而大量的塑料使用和排放给环境带来日益严重的污染，尤其是小尺寸塑料垃圾。微塑料（Microplastics，MPs）是指粒径小于5μm的塑料颗粒、碎片、纤维等，来源于工业原始塑料材料、个人护理品或由大粒径塑料降解而来。无脊椎动物（甲壳类、双壳软体类、多毛环节类）、脊椎动物（海鸟、海鱼）甚至哺乳动物（鲸鱼）都能摄入MPs，并且MPs能通过食物链从低营养级传递到高营养级，从而对生态环境产生不利影响。MPs的广泛存在和潜在危害引起了全世界范围的研究热潮。目前的研究重点在于阐明MPs在水生生物体内的富集和分布。现有的检测方法以定性为主，主要通过显微镜进行观察计数，进而得到MPs在生物体内的大致情况。现有方法的不足之处在于：（1）处理过程中存在主观性。显微镜观察计数时，区分MPs和其他类似物质（如砂砾）存在主观性和难以分辨性，易产生偏差。（2）实验结果只能定性，无法进行准确定量。荧光示踪技术由于高灵敏度和选择性，常被用来观察目标物的位置和进行定量测量，而将该技术应用于定量检测MPs在水生生物体内的富集和分布，可以大大提高检测的精准度，且尚无相关报道。
技术实现思路
针对现有方法不能准确分析MPs在水生生物体内的富集和分布的难题，本专利技术提供一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法该方法主要是通过荧光示踪技术实现，检测灵敏度高，重复性好。本专利技术采用的技术方案如下：一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）染毒实验：选择荧光标记的微塑料颗粒作为受试物，配制染毒物质溶液体系，以去离子水作为空白对照，选取水生生物作为受试生物，进行染毒实验；（2）样品采集：染毒周期结束后，解剖受试生物，采集目标组织器官，冷冻干燥后称重；（3）组织消解：将步骤（2）中的冻干组织置于浓硝酸中消解，消解完成后定容，配制待测样品溶液；（4）标准曲线：配制不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，荧光光谱仪设置特定激发波长和发射波长后测定各溶液的荧光强度，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线；（5）样品测定：在步骤（4）的激发和发射波长下，测定待测样品溶液的荧光强度，根据标准曲线计算相应浓度，浓度乘上定容后体积得到微塑料含量；（6）含量换算：步骤（5）得到的微塑料含量与对应的组织干重中对比，换算得到单位质量组织中微塑料的含量，其中染毒组样品的结果要扣除空白对照组的背景值，得到最终结果。在以上方案中，在步骤（1）中，染毒实验的周期是一周。进一步，在步骤（2）中，在采集目标组织器官后，将采集到的组织冷冻干燥72小时，称重得到的重量是干重。优选地，在以上步骤（2）中所采集的目标组织器官是水生生物的肝脏、肠、腮中的任一个或组合，更优选是不同器官的组合。在本专利技术方法中，步骤（3）中消解组织的条件是将冻干组织加入1mL浓硝酸中，70℃下消解2h。优选地，荧光光谱仪和荧光检测的激发波长和发射波长分别为418nm和518nm。有益效果：本专利技术基于荧光示踪技术，提供一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法。该专利技术技术方案具有设备简单、操作简便的优点，处理条件温和，方法灵敏度高，重复性好。使用的荧光示踪技术灵敏度高，可有效对荧光MPs进行定量，达到测定目的。该方法弥补了目前对MPs在水生生物体内富集分布检测方法的不足，改进现有技术在MPs定量过程中的主观性和偏差，实现有效定量检测，有利于准确分析微塑料在各种水生生物体内的富集和分布规律，为揭示微塑料的生物毒性提供基础数据。附图说明图1为本专利技术技术方案的流程图。图2荧光5μm-MPs-PS的标准曲线图。图3荧光20μm-MPs-PS的标准曲线图。图4荧光MPs-PS在斑马鱼鳃中的含量图。图5荧光MPs-PS在斑马鱼肝脏中的含量图。图6荧光MPs-PS在斑马鱼肠中的含量图。具体实施方式本专利技术公开了一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，该方法的步骤如下：（1）染毒实验：选择受试物质为荧光标记的微塑料颗粒，配制染毒物质溶液体系，以去离子水作为空白对照，选取受试生物，进行染毒实验；（2）样品采集：染毒周期结束后，解剖受试生物，采集目标组织器官（如腮、肝、肠等），冷冻干燥72h后称干重；（3）组织消解：将步骤（2）中的冻干组织置于1mL浓硝酸中，70℃消解2h后用超纯水定容至5mL，得到待测样品溶液；（4）标准曲线：配制不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，荧光光谱仪设置特定激发波长和发射波长后测定各溶液的荧光强度，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线；（5）样品测定：在步骤（4）的激发和发射波长下，测定待测样品溶液的荧光强度，根据标准曲线计算相应浓度，浓度乘上定容后体积得到微塑料含量。（6）含量换算：步骤（5）得到的微塑料含量与对应的组织干重中对比，换算得到单位质量组织中微塑料的含量；其中染毒组样品的结果要扣除空白对照组的背景值，得到最终结果。在上述方案中优选的是，所述步骤（1）中使用的是荧光标记的微塑料颗粒。在上述方案中优选的是，所述步骤（3）中消解组织的条件：冻干组织加入1mL浓硝酸，70℃消解2h。在上述方案中优选的是，所述步骤（4）中标准曲线的绘制：配制不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制标准曲线，用来定量检测组织中的微塑料含量。下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。实施例定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的实验包括如下步骤。（1）染毒实验：以荧光标记的微塑料聚苯乙烯颗粒（MPs-PS）做为受试物，受试动物为成熟健康的斑马鱼（Daniorerio，5月龄，0.29±0.02g），随机分为染毒组和对照组，每组包含3个平行，每个平行使用5条鱼，染毒周期为7天。对照组使用紫外消毒的曝气自来水，染毒组分别使用5μm和20μm荧光MPs-PS（5μm-MPs-PS，20μm-MPs-PS，激发波长418nm，发射波长518nm），用与对照组一致的紫外消毒曝气自来水配制20mg/LMPs-PS体系。其他实验条件如下：温度：24±1℃，pH：7.2±0.5，溶解氧：6.6±0.3mg/L，电导率：0.256±0.005mS/cm，硬度：185±9mg/LCaCO3。（2）样品采集：染毒7天后，解剖染毒组和对照组斑马鱼，采集目标组织器官（鳃、肝、肠），每个平行中5条鱼的组织混合作为一个样，冷冻干燥72h称干重，并做好记录。作为一个更优选的方案，可以将每条鱼的不同器官组织混合作为一个样品。（3）组织消解：将一个样品中冻干的所有组织置于1mL浓硝酸中，70℃消解2h后用超纯水定容至5mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）染毒实验：选择荧光标记的微塑料颗粒作为受试物，配制染毒物质溶液体系，以去离子水作为空白对照，选取水生生物作为受试生物，进行染毒实验；（2）样品采集：染毒周期结束后，解剖受试生物，采集目标组织器官，冷冻干燥后称重；（3）组织消解：将步骤（2）中的冻干组织置于浓硝酸中消解，消解完成后定容，配制待测样品溶液；（4）标准曲线：配制不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，荧光光谱仪设置特定激发波长和发射波长后测定各溶液的荧光强度，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线；（5）样品测定：在步骤（4）的激发和发射波长下，测定待测样品溶液的荧光强度，根据标准曲线计算相应浓度，浓度乘上定容后体积得到微塑料含量；（6）含量换算：步骤（5）得到的微塑料含量与对应的组织干重中对比，换算得到单位质量组织中微塑料的含量，其中染毒组样品的结果要扣除空白对照组的背景值，得到最终结果。

【技术特征摘要】
1.一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）染毒实验：选择荧光标记的微塑料颗粒作为受试物，配制染毒物质溶液体系，以去离子水作为空白对照，选取水生生物作为受试生物，进行染毒实验；
（2）样品采集：染毒周期结束后，解剖受试生物，采集目标组织器官，冷冻干燥后称重；
（3）组织消解：将步骤（2）中的冻干组织置于浓硝酸中消解，消解完成后定容，配制待测样品溶液；
（4）标准曲线：配制不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，荧光光谱仪设置特定激发波长和发射波长后测定各溶液的荧光强度，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线；
（5）样品测定：在步骤（4）的激发和发射波长下，测定待测样品溶液的荧光强度，根据标准曲线计算相应浓度，浓度乘上定容后体积得到微塑料含量；
（6）含量换算：步骤（5）得到的微塑料含量与对应的组织干重中对比，换算得到单位质量组织中微塑料的含量，其中染毒组样品的结果要扣除空白对照组的背景值，得到最终结果。

【专利技术属性】
技术研发人员：张宴，陆熠峰，邓永锋，任洪强，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32