核酸酶概况分析系统技术方案

本公开的一些方面提供了用于确定核酸酶靶位点偏好性和位点特异性内切核酸酶的特异性的策略、方法和试剂。本文中提供的一些方法利用了新的“单切割”策略来筛选包含候选核酸酶靶位点和恒定插入区的重复单元的多联体文库，经由对临近和等同于切割靶位点的完整靶位点测序，从而鉴定出可由感兴趣的核酸酶切割的文库成员。本公开的一些方面提供了基于测定位点特异性内切核酸酶的靶位点偏好性和特异性，用于选择位点特异性内切核酸酶的策略、方法和试剂。还提供了用于测定靶位点偏好性和特异性的方法和试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求35U.S.C.§365(c)下对2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N14/320,370和2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N14/320,413的优先权，而且还要求35U.S.C.§119(e)下对2013年8月9日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/864,289的优先权，其各自通过提述并入本文。政府支持在美国政府支持下，本专利技术在国防高等研究计划署(DefenseAdvancedResearchProjectsAgency)资助的项目号HR0011-11-2-0003和N66001-12-C-4207下进行。美国政府对本专利技术具有某些权利。专利技术背景位点特异性内切核酸酶理论上允许靶向性操作基因组内的单个位点且可用于基因靶向以及治疗应用的背景中。在包括哺乳动物在内的多种生物体中，位点特异性内切核酸酶被用于基因组工程，其通过刺激非同源末端连接或同源重组进行。除了提供强大的研究工具以外，位点特异性核酸酶还具有作为基因治疗剂的潜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定核酸酶的靶位点的方法，该方法包括：(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5′磷酸模块的经切割的核酸链；(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在适合所述核酸酶切割包含所述核酸酶的靶位点的候选核酸分子的条件下接触，其中每个核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和恒定的插入序列；和(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过测定在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点的序列进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.09 US 61/864,289;2014.06.30 US 14/320,370;1.一种用于鉴定核酸酶的靶位点的方法，该方法包括：
(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5′磷酸模
块的经切割的核酸链；
(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在适合所述核酸酶切割包含所述核酸酶的
靶位点的候选核酸分子的条件下接触，其中每个核酸分子包含序列的多联体，所述序列包
含候选的核酸酶靶位点和恒定的插入序列；和
(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过测定在步骤(b)中被所述
核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点的序列进行。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸酶创建平末端。
3.权利要求1的方法，其中所述核酸酶创建5′突出。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(c)的所述测定包括经由5′-磷酸依赖性连
接将第一核酸接头连接至在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链的5′端。
5.权利要求4的方法，其中所述核酸接头以双链形式提供。
6.权利要求5的方法，其中所述5′-磷酸依赖性连接是平端连接。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述方法包括在将所述第一核酸接头连接至被
所述核酸酶切割的核酸链之前填补5′突出。
8.权利要求4-7中任一项的方法，其中步骤(c)的所述测定进一步包括使用与所述接头
杂交的PCR引物和与所述恒定插入序列杂交的PCR引物经由PCR反应扩增被核酸酶切割的多
联体的片段，该片段包含未切割的靶位点。
9.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括对所述扩增的核酸分子富集包含单个
未切割靶序列的分子。
10.权利要求9的方法，其中所述富集包括大小分级。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(c)的所述测定包括对在步骤(b)中被所
述核酸酶切割的核酸链或经由PCR获得的其拷贝测序。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述候选核酸分子的文库包含至少108、至少
109、至少1010、至少1011或至少1012个不同的候选核酸酶切割位点。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述核酸酶是治疗性核酸酶，其切割与疾病有
关的基因中的特定核酸酶靶位点。
14.权利要求13的方法，其进一步包括测定所述治疗性核酸酶切割该特定的核酸酶靶
位点且不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或无另外的核酸酶靶位点的所
述治疗性核酸酶的最大浓度。
15.权利要求14的方法，其进一步包括将所述治疗性核酸酶以有效生成等于或低于所
述最大浓度的最终浓度的量施用给受试者。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述核酸酶是与RNA分子形成复合物的可RNA
编程的核酸酶，且其中该核酸酶:RNA复合物特异性结合与所述RNA分子的序列互补的核酸
序列。
17.权利要求16的方法，其中所述RNA分子是单导引RNA(sgRNA)。
18.权利要求16的方法，其中所述sgRNA包含与所述靶序列互补的15-25、19-21或20个
核苷酸。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述核酸酶靶位点包含[sgRNA-互补性序
列]-[原间隔区临近基序(PAM)]结构，且所述核酸酶切割所述sgRNA互补性序列内的靶位
点。
21.权利要求20的方法，其中所述sgRNA互补性序列包含10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
22.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述核酸酶包含非特异性核酸切割域。
23.权利要求22的方法，其中所述核酸酶包含FokI切割域。
24.权利要求22或23的方法，其中所述核酸酶包含核酸切割域，其在切割域二聚化时切
割靶序列。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述核酸酶包含特异性结合核酸序列的结合
域。
26.权利要求25的方法，其中所述结合域包含锌指。
27.权利要求26的方法，其中所述结合域包含至少2、至少3、至少4或至少5个锌指。
28.权利要求22-27中任一项的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶。
29.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述结合域包含转录激活物样元件。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸酶是转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。
31.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述核酸酶包含有机化合物。
32.权利要求31的方法，其中所述核酸酶包含烯二炔。
33.权利要求31或32的方法，其中所述核酸酶是抗生素。
34.权利要求32或33的方法，其中所述化合物是达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素
(neocarzinostatin)、加利车霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicin)、博来霉
素、或其衍生物。
35.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述核酸酶是归巢式内切核酸酶。
36.核酸分子的文库，其包含多种核酸分子，其中每种核酸分子包含序列的多联体，所
述序列包含候选核酸酶靶位点和10-100个核苷酸的恒定插入序列。
37.权利要求36的文库，其中所述恒定插入序列长度为至少15、至少20、至少25、至少
30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80或至
少95个核苷酸。
38.权利要求36的文库，其中所述恒定插入序列长度不超过15、不超过20、不超过25、不
超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过
70、不超过75、不超过80、或不超过95个核苷酸。
39.权利要求36-39中任一项的文库，其中所述候选核酸酶靶位点是能被以下切割的位
点：可RNA编程的核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、归巢内切核
酸酶、有机化合物核酸酶、烯二炔、抗生素核酸酶、达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯
波霉素、和/或博来霉素。
40.权利要求39的文库，其中所述候选核酸酶靶位点能被Cas9核酸酶切割。
41.权利要求36-40中任一项的文库，其中所述文库包含至少105、至少106、至少107、...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，V帕塔纳亚克，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国;US