用于生物合成异戊二烯的方法技术

本文件描述了通过在从异丁酰-CoA，3-甲基-2-氧代戊酸，或4-甲基-2-氧代戊酸产生的中心前体中形成两个乙烯基基团产生异戊二烯的生物化学途径以及用于产生异戊二烯的重组宿主。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2013年8月5日提交的美国申请系列号61/862,401的优先权，其公开通过提述以其整体并入。
本专利技术涉及使用一种或多种分离的酶例如脱水酶，单加氧酶，细胞色素P450，酰基-[acp]脱氢酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，和甲羟戊酸-3-激酶中的一种或多种；或使用表达一种或多种这些酶的重组宿主细胞生物合成异戊二烯的方法。专利技术背景对于生产特殊弹性体，包括电机安装/配件，手术手套，橡皮筋，高尔夫球和鞋子，异戊二烯是一种重要的单体。苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物形成热熔压敏粘合剂配制剂的关键组分，而反式-聚-异戊二烯用于轮胎的制造(Whited等，IndustrialBiotechnology,2010,6(3),152-163)。橡胶商品的制造依赖于进口来自巴西橡胶树的天然橡胶，或基于石油的合成橡胶聚合物(Whited等，2010,见上文)。考虑到对石油化工原料和树木采伐的依赖，生物技术提供了通过生物催化的替代方法。生物催化是使用生物催化剂，例如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。因而，针对此背景，很明显对于生产中间物，特别是异戊二烯的可持续方法有需要，其中所述方法是基于生物催化的。生物衍生原料和石油化工原料两者都是生物催化工艺的可行起始材料。在通过生物催化过程合成异戊二烯中，向中等碳链长度的酶底物中引入乙烯基基团是一个关键的考虑因素。在原核生物例如枯草芽孢杆菌和真核生物例如银白杨(Populusalba)中，存在引起异戊二烯合成的已知代谢途径(Whited等，2010,见上文)。可以通过通向前体二甲基乙烯基-PP的两种途径合成异戊二烯，例如甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径(Kuzuyama,Biosci.Biotechnol.Biochem.,2002,66(8),1619-1627)。所述甲羟戊酸途径包含一种脱羧酶，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(在下文中为MDD)，其将第一个乙烯基基团引入通向异戊二烯的前体中。第二个乙烯基基团由异戊二烯合酶(在下文中为ISPS)在异戊二烯合成的最终步骤中引入。所述甲羟戊酸途径(图1)已经在使用大肠杆菌作为宿主的异戊二烯生物催化生产中采用。工程化为具有甲羟戊酸途径的大肠杆菌需要三摩尔乙酰-CoA，三摩尔ATP和两摩尔NAD(P)H来生产一摩尔异戊二烯。考虑到甲羟戊酸途径的22.5％(w/w)的理论最大产出，已经以2g/(L·h)的体积计生产率从葡萄糖以和11％(w/w)的产率以生物催化生产异戊二烯(Whited等，2010,见上文)。特别地，甲羟戊酸到5-二磷酸甲羟戊酸的磷酸活化在代谢上是能量密集的，每摩尔异戊二烯合成需要两摩尔ATP(图1)。因此，减少ATP消耗可以改进该途径的效率。专利技术概述本专利技术人已经确定可构建生物化学途径来从(R)-甲羟戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸或异丁酰-CoA，通过引入两个乙烯基基团而不需要末端醇磷酸化来合成异戊二烯。这些途径依赖于脱水酶，单加氧酶，细胞色素P450，或脱氢酶来引入第一个乙烯基基团；和MDD，甲羟戊酸-3-激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶(例如，CurMTE)或芳樟醇脱水酶来将第二个乙烯基基团引入导致异戊二烯合成的前体。本文所述的方法可以包括引入第一个乙烯基基团，引入第二个乙烯基基团，或引入第一和第二乙烯基基团两者。在本专利技术之前，不知道能够引入两个乙烯基基团，而不需要末端醇磷酸化的酶可以用于生成非磷酸化的中间物用于异戊二烯合成。因此，本专利技术提供能够将中心前体甲羟戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸或异丁酰-CoA转化为异戊二烯的酶。在一些实施方案中，由归类于，例如EC4.2.1.-下的2-羟基酰基-CoA脱水酶，例如HadBC的基因产物(SEQIDNOs:3和4)及其引发剂HadI(SEQIDNO:2)，或HgdAB的基因产物(SEQIDNOs:6和7)及其引发剂HdgC(SEQIDNO:5)形成3-甲基-戊-2-烯酰-CoA或4-甲基-戊-2-烯酰-CoA。在一些实施方案中，所述2-羟基酰基-CoA脱水酶是酶工程的产物。从厌氧细菌分离的2-羟基酰基-CoA脱水酶拥有氨基酸降解途径中采用的常见催化机制。例如，来自艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的HadBC/HadI的基因产物催化(R)-2-羟基异己酰-CoA转化为异己酰-CoA(isocaprenoyl-CoA)。类似的，HgdAB/HdgC的基因产物催化2-羟基-戊二酰-CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)转化为戊烯二酰-CoA(glutaconyl-CoA)(Kim等，FEMSMicrobiol.Reviews,2004,28,455–468)。见图2-5。在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入3-甲基-戊-2-烯酰-CoA中，衍生于中心代谢物3-甲基-2-氧代戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸或3-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP(例如，如图2中所示)。已证明来自卡那链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)的tcsD的基因产物(SEQIDNO:14)对于直链和支链C5酰基-ACP底物具有脱氢酶活性(Mo等，JACS,2011,133,976-985)。在一些实施方案中，引入第一个乙烯基基团，形成4-甲基-戊-2-烯酰-ACP，衍生于中心代谢物4-甲基-2-氧代戊酸或异丁烯-CoA，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸，4-甲基-3-磺酰-戊-4-烯酰-ACP，或3-甲基-3-丁烯-2-醇(例如，见图3，图6和图7)。已经证明来自卡那链霉菌的tcsD的基因产物(SEQIDNO:14)对于4-甲基-戊-2-烯酰-ACP具有脱氢酶活性(Mo等，2011,见上文)。在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入3-甲基-3-羟基-戊酸，其可以在一个或多个步骤中酶促转化为酶促转化为3-甲基-3-羟基戊-4-烯酸(例如，见图4)。已经证明由mdpJ编码的单加氧酶(SEQIDNO:15)将末端双键引入结合到仲醇(secondaryalcohol)的烯丙基基团(等，Appl.Environ.Microbiol.,2012,78(17),6280-6284)。在一些实施方案中，将第一个乙烯基基团引入4-甲基-3-羟基戊酸，其可...

【技术保护点】
一种用于酶促合成异戊二烯的方法，所述方法包括向3‑甲基‑戊‑2‑烯酰‑[acp]，4‑甲基‑戊‑2‑烯酰‑[acp]，3‑甲基‑3‑羟基‑戊酸，4‑甲基‑3‑羟基戊酸，或甲羟戊酸以酶促引入末端乙烯基基团，并将所得的产物在一个或多个步骤中转化为异戊二烯。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.05 US 61/862,4011.一种用于酶促合成异戊二烯的方法，所述方法包括向3-甲基-戊-2-烯
酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，4-甲基-3-羟基戊酸，
或甲羟戊酸以酶促引入末端乙烯基基团，并将所得的产物在一个或多个步骤
中转化为异戊二烯。
2.权利要求1的方法，其中使用脱水酶，单加氧酶，细胞色素P450还原
酶，或酰基-[acp]脱氢酶引入第一个所述乙烯基基团。
3.权利要求1或2的方法，其中使用酰基-[acp]脱氢酶将所述末端乙烯基
基团引入3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]或4-甲基-戊-2-烯酰-[acp]中。
4.权利要求3的方法，其中所述酰基-[acp]脱氢酶与SEQIDNO:14中列
出的氨基酸序列具有至少70％的同源性。
5.权利要求1或2的方法，其中使用归类于EC4.2.1.-下的脱水酶将所述
末端乙烯基基团引入甲羟戊酸中。
6.权利要求5的方法，其中所述脱水酶(EC4.2.1.-)与SEQIDNO:22
中列出的氨基酸序列具有至少70％的同源性。
7.权利要求1或2的方法，其中使用单加氧酶或细胞色素P450还原酶将
所述末端乙烯基基团引入3-甲基-3-羟基-戊酸或4-甲基-3-羟基戊酸中。
8.权利要求7的方法，其中所述单加氧酶与SEQIDNO:15中列出的氨基
酸序列具有至少70％的同源性。
9.权利要求1-2任一项的方法，其中从3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧
代戊酸，或异丁酰-CoA酶促形成3-甲基-戊-2-烯酰-[acp]，4-甲基-戊-2-烯酰
-[acp]，3-甲基-3-羟基-戊酸，或4-甲基-3-羟基戊酸。
10.一种用于酶促合成异戊二烯的方法，所述方法包括向3-甲基-3-羟基-
戊-4-烯酸，4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸，4-甲基-3-磺酰戊-4-烯酰-[acp]，或3-甲
基-3-丁烯-2-醇引入第二个末端乙烯基基团以产生异戊二烯。
11.权利要求10的方法，其中使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶，甲羟戊酸3-
激酶，酰基-[acp]脱羧硫酯酶，或芳樟醇脱水酶引入所述第二个乙烯基基团。
12.权利要求11的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶与SEQIDNO:
8-11中列出的任一项氨基酸序列的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶具有至少70％的同
源性。
13.权利要求11或12的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶在与SEQ
IDNO:11的残基74比对的位置处具有组氨酸和/或与SEQIDNO:11的残基
145比对的位置处具有苯丙氨酸。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶具有
SEQIDNO:11中列出的氨基酸序列，只是在位置74处用组氨酸取代精氨酸
和/或在位置145处用苯丙氨酸取代异亮氨酸。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述甲羟戊酸二磷酸脱羧酶将3-
甲基-3-羟基戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯。
16.权利要求10或11的方法，其中所述甲羟戊酸3-激酶将3-甲基-3-羟基
戊-4-烯酸或4-甲基-3-羟基戊-4-烯酸转化为异戊二烯。
17.权利要求16的方法，其中所述甲羟戊酸3-激酶与SEQIDNO:12的氨
基酸序列具有至少70％的同源性。
18.权利要求10或11的方法，其中所述酰基-[acp]脱羧硫酯酶将3-甲基-3-
磺酰戊-4-烯酰-[acp]或4-甲基-3-磺酰戊-4-烯酰-[acp]转化为异戊二烯。
19.权利要求18的方法，其中所述酰基-[acp]脱羧硫酯酶与SEQIDNO:
21的氨基酸序列具有大于70％的同源性。
20.权利要求10或11的方法，其中所述芳樟醇脱水酶将3-甲基-3-丁烯-2-
醇转化为异戊二烯。
21.权利要求20的方法，其中所述芳樟醇脱水酶与SEQIDNO:13的氨基
酸序列具有至少70％的同源性。
22.前述权利要求任一项的方法，其中使用分离的酶进行所述方法。
23.前述权利要求任一项的方法，其中使用包含所述酶的细胞裂解物进
行所述方法。
24.前述权利要求任一项的方法，其中在重组宿主中进行所述方法。
25.权利要求24的方法，其中所述宿主是原核生物或真核生物。
26.权利要求25的方法，其中所述原核宿主来自埃希氏菌属
(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichiacoli)；来自梭菌属(Clostridia)如
杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium
autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)；来自棒状杆菌属
(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；来自
贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)或耐金属贪铜

\t菌(Cupriavidusmetallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假
单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；
来自芽孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH