一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，包括以下步骤：预处理，多糖提取，多糖纯化，色谱指纹图谱的建立，未知种类白及的鉴定。本发明专利技术的优点在于：能通过白及主要药效成分‑白及多糖的分子量分布来有效区分和鉴别三种药用白及，能弥补中国药典2015版设定的白及鉴定方法的不足，因为后者是利用硅胶薄层点样层析的出现目的斑点的来作为其质量评价和判断标准，是一种单一的信息反馈，制假者利用检测方法的漏洞可以造假，而本方法更贴近化学组分的本质，是更精细的信息，制假者几乎无法仿制或仿制成本昂贵。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兰科白及属药用植物产品的鉴别和质量控制方法
，尤其涉及一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法。
技术介绍
药材白及为兰科白及属植物白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥块茎，是我国传统止血生肌药，中医临床用于咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂。白及属(BletillaRchb.)植物全世界有6种，分布于亚洲的缅甸北部经我国至日本。我国产4种：华白及Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.Schltr.、小白及Btetillaformosana(Hayata)Schltr.、黄花白及BletillaochraceaSchltr、紫花三叉白及Bletillastriate(Thunb.exA.Murray)Rchb.f.。而市场认可度和药用价值最高的种是紫花三叉白及，且绝大多数的栽培品种也是紫花三叉白及，其种源90％来源于“江西群落”和“贵州群落”，种植面积大致是贵州占20％(约1500亩)，云南占18％，四川占15％，安徽占15％，湖北占12％，江苏、广西、湖南、陕西各占5％。现代药理研究显示白及块茎中含有多种有效药用成分，水溶性多糖则是其主要药用成分。作为天然高分子材料，白及多糖同时具有功能缓释性、局部滞留性、自身降解性、无刺激性、无毒副作用等辅料的特性，在现代药物制备中的作用越来越重要。多糖类化合物作为天然药物的主要活性成分之一，其活性与其多糖的空间结构及分子量分布密切相关，为探索其组分和药效的相关性，本方案将采用高效体积排阻色谱法(HPSEC)对同一产地不同种类白及多糖的相对分子质量的分布进行比较分析，从不同分子量多糖的比例和分布来表征不同物种白及多糖的结构特点，建立HPSEC色谱指纹图谱为后续质量标准的制定提供可行办法。而迄今为止，未见关于利用HPSEC色谱建立药用白及多糖色谱指纹图谱的公开报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种更准确可靠的鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，该图谱方法是根据三种药用白及主要药效基础物质多糖建立的HPSEC色谱图谱。本专利技术建立的多糖分子量分布图谱能有效区分不同白及种类，既可弥补药典中利用硅胶薄层点样层析的出现目的斑点的来判断白及优劣和真伪的不足，也可用来鉴别三种药用白及(小白及Btetillaformosana(Hayata)Schltr.；黄花白及BletillaochraceaSchltr；紫花三叉白及Bletillastriate(Thunb.exA.Murray)Rchb.f.)与其他种白及属植物。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，包括如下步骤：(1)：预处理将按照统计学方法取样得到的已知不同品种的药用白及材料切成薄片后混合，于60-70℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末；(2)：多糖提取①采用80℃-90℃的无水乙醇索氏提取步骤(1)中所得粉末至回流液无色，挥干溶剂，将所得白及药渣按照料液比(1-2)：(4-6)加入蒸馏水中，并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取3-5次，每次2-3h；②合并滤液并向滤液中添加质量分数为0.3％-0.5％的活性炭混匀脱色，于60℃-65℃环境下静置1-2h后抽滤；③抽滤后，将上述溶液于60℃-65℃在旋转蒸发仪进行负压浓缩为原体积的30％-35％，再加入无水乙醇，使其终浓度达到80％-85％(v/v)，再于3-5℃冰箱中静置2-3h，接着，3000-4000r/min转速下离心10-20min后留取沉淀；④将沉淀用蒸馏水溶解即得药用白及粗多糖溶液；(3)：多糖纯化对步骤(2)所得的粗多糖溶液进行进一步的多糖纯化；(4)：色谱指纹图谱的建立①将不同分子量的葡聚糖标准品配置成4-5mg/mL的水溶液分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC中，再根据各相应色谱图计算多糖分子量标准曲线方程；②多糖纯化后的药用白及样品分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC，获取相应色谱图，再根据多糖分子量标准曲线方程计算出各样品的色谱曲线各部分的相对分子量，最终建立相应已知的药用白及样品的HPSEC代表模式色谱图谱；(5)：未知种类白及的鉴定将未知种类的白及按照以上步骤(1)-(4)进行处理，以得到其对应色谱指纹图谱，再将其与已建立的已知的白及样品的色谱指纹图谱进行相似度比较，当其相似度大于90％以上时，即可判定为同一类白及属植物，否则不是同一种属。优选地，所述步骤(1)中不同品种药用白及的品种分别为：紫花三叉白及、黄花白及与小白及。优选地，所述步骤(1)中药用白及材料为药用白及鲜品块茎或干燥块茎。优选地，所述步骤(1)中统计学方法为：分别在贵州、云南、四川、安徽四个地区按照五点取样法收集药用白及样本。优选地，所述步骤(3)中多糖纯化采用Sevage法：按照样品与萃取剂体积比(3-5)：(0.5-2)加入Sevage试剂，混匀，振荡25-35min，以3000-4000r/min离心5-10min，弃去除下层氯仿及中层变性蛋白；再取上层水溶液重复去蛋白操作，至无明显中层为止；最后，收集去蛋白后的上层水溶液，通过超滤装置超滤，脱去小分子物质，即得到纯化后的多糖浓缩溶液。优选地，所述Sevage试剂为体积比分别为(3-5)∶(0.5-1.5)的氯仿与正丁醇的混合液。优选地，所述超滤装置为滤膜截留分子量为1K的超滤装置。优选地，所述步骤(4)中不同分子量的葡聚糖标准品的重均分子量Mw分别为：2000KDa、580KDa、70KDa、10KDa、5KDa。优选地，所述步骤(4)中多糖分子量标准曲线方程的计算方法为：根据各葡聚糖标准品的色谱峰保留时间和分子量对数，以标准品的分子量对数lgMw为纵坐标，色谱峰保留时间Rt为横坐标，使用线性方程拟合得多糖分子量标准曲线方程。优选地，进行高效体积排阻色谱HPSEC检测时相应色谱条件为：流动相为0.1M醋酸钠，流速为0.5mL/min，柱温为45℃，进样量为20uL。本专利技术的优点在于：本专利技术提供的三种白及多糖分子量分布的HPSEC色谱指纹图谱为代表模式图谱，利用中国药典委员会出品的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件进行判定，能通过白及主要药效成分-白及多糖的分子量分布来有效区分和鉴别三种药用白及，其方法能弥补中国药典2015版设定的白及鉴定方法的的不足，因为后者是利用硅胶薄层点样层析的出现目的斑点的来作为其质量评价和判断标准，是一种单一的信息反馈，制假者利用检测方法的漏洞可以造假，而本方法更贴近化学组分的本质，是更精细的信息，制假者几乎无法仿制或仿制成本昂贵。附图说明图1是本专利技术实施例1-2提供的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法的流程图。图2是本专利技术实施例1提供的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法的紫花三叉白及多糖的分子量分布图；图3是本专利技术实施例1提供的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法的黄花白及多糖的分子量分布图；图4是本专利技术实施例1提供的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法的小白及多糖的分子量分布图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)：预处理将按照统计学方法取样得到的已知不同品种的药用白及材料切成薄片后混合，于60‑70℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末；(2)：多糖提取①采用80℃‑90℃的无水乙醇索氏提取步骤(1)中所得粉末至回流液无色，挥干溶剂，将所得白及药渣按照料液比(1‑2)：(4‑6)加入蒸馏水中，并于75℃‑85℃水浴冷凝回流提取3‑5次，每次2‑3h；②合并滤液并向滤液中添加质量分数为0.3％‑0.5％的活性炭混匀脱色，于60℃‑65℃环境下静置1‑2h后抽滤；③抽滤后，将上述溶液于60℃‑65℃在旋转蒸发仪进行负压浓缩为原体积的30％‑35％，再加入无水乙醇，使其终浓度达到80％‑85％(v/v)，再于3‑5℃冰箱中静置2‑3h，接着，3000‑4000r/min转速下离心10‑20min后留取沉淀；④将沉淀用蒸馏水溶解即得药用白及粗多糖溶液；(3)：多糖纯化对步骤(2)所得的粗多糖溶液进行进一步的多糖纯化；(4)：色谱指纹图谱的建立①将不同分子量的葡聚糖标准品配置成4‑5mg/mL的水溶液分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC中，再根据各相应色谱图计算多糖分子量标准曲线方程；②多糖纯化后的药用白及样品分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC，获取相应色谱图，再根据多糖分子量标准曲线方程计算出各样品的色谱曲线各部分的相对分子量，最终建立相应已知的药用白及样品的HPSEC代表模式色谱图谱；(5)：未知种类白及的鉴定将未知种类的白及按照以上步骤(1)‑(4)进行处理，以得到其对应色谱指纹图谱，再将其与已建立的已知的白及样品的色谱指纹图谱进行相似度比较，当其相似度大于90％以上时，即可判定为同一类白及属植物，否则不是同一种属。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)：预处理将按照统计学方法取样得到的已知不同品种的药用白及材料切成薄片后混合，于60-70℃的烘箱中烘干至恒重并粉碎成粉末；(2)：多糖提取①采用80℃-90℃的无水乙醇索氏提取步骤(1)中所得粉末至回流液无色，挥干溶剂，将所得白及药渣按照料液比(1-2)：(4-6)加入蒸馏水中，并于75℃-85℃水浴冷凝回流提取3-5次，每次2-3h；②合并滤液并向滤液中添加质量分数为0.3％-0.5％的活性炭混匀脱色，于60℃-65℃环境下静置1-2h后抽滤；③抽滤后，将上述溶液于60℃-65℃在旋转蒸发仪进行负压浓缩为原体积的30％-35％，再加入无水乙醇，使其终浓度达到80％-85％(v/v)，再于3-5℃冰箱中静置2-3h，接着，3000-4000r/min转速下离心10-20min后留取沉淀；④将沉淀用蒸馏水溶解即得药用白及粗多糖溶液；(3)：多糖纯化对步骤(2)所得的粗多糖溶液进行进一步的多糖纯化；(4)：色谱指纹图谱的建立①将不同分子量的葡聚糖标准品配置成4-5mg/mL的水溶液分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC中，再根据各相应色谱图计算多糖分子量标准曲线方程；②多糖纯化后的药用白及样品分别进样于高效体积排阻色谱HPSEC，获取相应色谱图，再根据多糖分子量标准曲线方程计算出各样品的色谱曲线各部分的相对分子量，最终建立相应已知的药用白及样品的HPSEC代表模式色谱图谱；(5)：未知种类白及的鉴定将未知种类的白及按照以上步骤(1)-(4)进行处理，以得到其对应色谱指纹图谱，再将其与已建立的已知的白及样品的色谱指纹图谱进行相似度比较，当其相似度大于90％以上时，即可判定为同一类白及属植物，否则不是同一种属。2.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白及的色谱指纹图谱方法，其特征在于，所述步骤(1)中不同品种药用白及的品种分别为：紫花三叉白及、黄花白及与小白及。3.根据权利要求1所述的一种鉴别三种药用白...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓辉，陈乃富，韩邦兴，王广林，孙传伯，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34