一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法技术

一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法，属于检测技术领域。由于弱疏水作用，聚甲基丙烯酸甲酯可以吸附一些疏水性的蛋白以及多肽，因此，我们以聚甲基丙烯酸甲酯点修饰的疏水硅纳米柱阵列提供均匀的吸附位点，倒扣在搅拌的待测物分子的溶液中，取出时，由于该阵列的疏水作用，不会有液膜在表面，杜绝了咖啡环效应，而分子均匀吸附在每一个纳米柱，最后滴加基质，由于配制溶液的乙腈和三氟乙酸都是极易挥发的溶剂，挥发速度大于分子向两端迁移的速度，因此，基质晾干后也不会有咖啡环效应。总之，我们这种方法保证了分子和基质的均匀分布，很大程度上提高了待测分子的检测重复性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测
，具体为一种通过解决由于分子与基质共结晶不均匀以及咖啡环效应导致的待测物分子在传统靶板上分布不均匀的问题(即甜点效应)，进而提高检测信号的重复性，以改进质谱检测的方法。
技术介绍
基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪是鉴定多肽、蛋白质、脂质、以及多种聚合物强有力的工具，应用范围较广泛。其原理是当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸取能量，基质-样品之间发生能量转移从而使得样品发生解吸电离，电离的样品在电场的作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。实际检测过程是随机选择样品的被测点，从中可以看出被检测信号的均匀性是衡量检测方法准确的前提。传统的基质辅助激光解吸电离质谱制备样品的方法是(从下往上)：分子-基质，基质-分子-基质，分子基质混合，然后再对样品进行晾干。由于基质-分子的共结晶不均匀，以及样品溶液晾干时的咖啡环效应，分子在基底上分布极其不均匀，而由于分子聚集导致信号很强的区域被称作是“甜点”。这种分子的分布不均匀使得检测时点与点之间信号差异特别大，最终导致选点时存在偶然性以及主观性，不能对实验结果进行准确的分析。因此，也有很多研究者做过许多相关工作，为了减弱咖啡环效应，电润湿法，快速蒸发法，增加混合样品的粘度以及真空沉积等方法被提出，但是，由于不能控制不同分子间的相互作用，这些工作依然无法实现基质和待测物分子的均匀共结晶。此外，也有一部分研究工作者设计制备特定的基质来解决共结晶的问题，但是这些基质和分子之间的相互作用一般都是基于官能团之间的相互作用，他们对于待测物分子的检测不具有普适性。另外，他们在利用这些基质进行辅助检测的时候，几乎都没有考虑混合溶液晾干过程中存在的咖啡环效应，这也会导致分子分布不均匀。无论是从解决咖啡环效应还是从解决基质和待测物分子不均匀共结晶的问题方面出发，虽然都得到了比较好的检测重复性，有的甚至得到低于10％的相对标准偏差，但是基于技术方法的缺陷，导致他们选的点数比较少，一般都少于十个点，这对判定解决方法的好坏不具有很大的说服力。因此，目前对于甜点效应的改善方法，存在解决不彻底的问题，从而导致只有在选取少量测试点的前提下才可以有好的重复性，具有一定的偶然性。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列来解决基质辅助激光解吸电离质谱分析中存在的检测信号重复性不好的问题。由于弱疏水作用，聚甲基丙烯酸甲酯可以吸附疏水性的蛋白和多肽，而聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列能够提供均匀的待测物吸附位点，因此我们将其作为基质辅助激光解吸电离质谱的基底。首先将基底置于待测物溶液的液面上，同时对溶液进行搅拌，将分子吸附到基底表面。由于该基底的疏水作用，将其从溶液中取出时表面没有溶液残留，因此待测分子不会生成咖啡环，从而去除了咖啡环效应。同时，纳米柱阵列及均匀分布在柱上的聚甲基丙烯酸甲酯使得待测分子均匀分布在基底上，然后以极易挥发的乙腈和三氟乙酸为溶剂配制基质溶液并将其滴加到基底上，由于溶剂挥发速度大于分子向边缘迁移的速度，因此基质在溶剂挥发后不会生成咖啡环，而是均匀分布在吸附了待测分子的基底上，保证了分子和基质的均匀分布。我们这种方法有效地去除了甜点效应，提高了基质辅助激光解吸电离质谱的检测重复性。本专利技术所述的一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法，具体步骤如下：(1)在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(2)在覆盖聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球；(3)利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜对硅进行刻蚀；(4)利用有机溶剂除去残留的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列；(5)在得到的有序硅纳米柱阵列上通过组装氟硅烷单层分子膜进行表面修饰，得到疏水有序硅纳米柱阵列；(6)在氟修饰的疏水有序硅纳米柱阵列上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(7)对聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列进行加热，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(8)用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列吸附待测分子；(9)滴加基质分子溶液到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(10)晾干步骤(9)中制备的样品，进行质谱检测。上述方法中，步骤(1)所述的在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，包括如下几个步骤：①清洗硅片：将多片硅片依次用丙酮、氯仿、乙醇和去离子水在40～100W下超声清洗3～10min，再用NH3·H2O：H2O2：H2O体积比为1～3：1～3：5～7的混合溶液在80～100℃下加热清洗50～70min，最后用去离子水冲洗并用氮气吹干，分别得到提球硅片和排球硅片；②旋涂聚甲基丙烯酸甲酯：将用二甲苯配制的质量分数为5％～7.5％的聚甲基丙烯酸甲酯(分子量为97000～350000)溶液滴加到步骤①清洗好的提球硅片上，以2000rpm～7000rpm的速度进行旋涂，得到旋涂有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底，聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的厚度范围是100～300nm。步骤(2)所述的在有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球，包括如下几个步骤：①配制聚苯乙烯微球(直径为100～4000nm)的乙醇和去离子水的混合溶液：将直径100～4000nm的聚苯乙烯粉末0.1～1g加入到1～20mL、体积比1：1的去离子水和乙醇的混合溶液中，超声1～6h，使其混匀；②聚苯乙烯微球单层膜的组装及转移：在干净表面皿中加入去离子水，并加入20～100μL质量分数为0.5％～2％的表面活性剂十二烷基硫酸钠水溶液；然后用微量进样器将步骤①得到的聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水混合溶液缓慢滴加到排球硅片上，并沿着排球硅片滑入水中，使其形成六方紧密堆积的聚苯乙烯微球单层膜，再加入5～25μL上述十二烷基硫酸钠水溶液使单层膜稳定；然后用具有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底将聚苯乙烯微球提起，并倾斜放置直至水分完全挥发。步骤(3)所述的利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜进行硅的刻蚀，包括如下步骤：①减小聚苯乙烯微球的粒径：将表面带有聚苯乙烯微球单层膜的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：O2流量为10～50sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为15～200W，电感耦合等离子体功率为50～150W；刻蚀时间为1～15min，刻蚀后聚苯乙烯微球的粒径减小为80～3500nm.②硅的刻蚀：将减小了聚苯乙烯微球粒径的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：SF6流量为5～15sccm，CHF3流量为30～60sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为15～50W，电感耦合等离子体功率为50～150W，刻蚀时间为1～9min。步骤(4)所述的利用有机溶剂除去剩余的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列，具体步骤如下：将步骤(3)刻蚀完的提球硅片依次放在丙酮、氯仿、乙醇和去离子水中以40～100W功率超声清洗3～10min，直至将剩余的聚苯乙烯微球除掉为止，从而得到有序硅纳米柱阵列,硅纳米柱的直径为50～3000nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法，其步骤如下：(1)在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(2)在覆盖聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球；(3)利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜对硅进行刻蚀；(4)利用有机溶剂除去残留的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列；(5)在得到的有序硅纳米柱阵列上通过组装氟硅烷单层分子膜进行表面修饰，得到疏水有序硅纳米柱阵列；(6)在氟修饰的疏水有序硅纳米柱阵列上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(7)对聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列进行加热，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(8)用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列吸附待测分子；(9)滴加基质分子溶液到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(10)晾干步骤(9)中制备的样品，进行质谱检测。

【技术特征摘要】
1.一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法，其步骤如下：(1)在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(2)在覆盖聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球；(3)利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜对硅进行刻蚀；(4)利用有机溶剂除去残留的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列；(5)在得到的有序硅纳米柱阵列上通过组装氟硅烷单层分子膜进行表面修饰，得到疏水有序硅纳米柱阵列；(6)在氟修饰的疏水有序硅纳米柱阵列上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；(7)对聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列进行加热，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(8)用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列吸附待测分子；(9)滴加基质分子溶液到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；(10)晾干步骤(9)中制备的样品，进行质谱检测。2.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列，其特征在于：步骤(1)所述的在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，包括如下步骤，①清洗硅片：将多片硅片依次用丙酮、氯仿、乙醇和去离子水在40～100W下超声清洗3～10min，再用NH3·H2O：H2O2：H2O体积比为1～3：1～3：5～7的混合溶液在80～100℃下加热清洗50～70min，最后用去离子水冲洗并用氮气吹干，分别得到提球硅片和排球硅片；②旋涂聚甲基丙烯酸甲酯：将用二甲苯配制的质量分数为5％～7.5％、分子量为97000～350000的聚甲基丙烯酸甲酯溶液滴加到步骤①清洗好的提球硅片上，以2000rpm～7000rpm的速度进行旋涂，得到覆盖了聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底，聚甲基丙烯酸甲酯的厚度范围是100～300nm。3.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列，其特征在于：步骤(2)所述的在覆盖聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球，包括如下步骤，①配制直径为100～4000nm的聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水的混合溶液：将直径100～4000nm的聚苯乙烯粉末0.1～1g加入到1～20mL、体积比1：1的去离子水和乙醇的混合溶液中，超声1～6h，使其混匀；②聚苯乙烯微球单层膜的组装及转移：在干净表面皿中加入去离子水，并加入20～100μL质量分数为0.5％～2％的表面活性剂十二烷基硫酸钠水溶液；然后用微量进样器将步骤①得到的聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水混合溶液缓慢滴加到排球硅片上，并沿着排球硅片滑入水中，使其形成六方紧密堆积的聚苯乙烯微球单层膜，再加入5～25μL上述十二烷基硫酸钠水溶液使单层膜稳定；然后用具有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底将聚苯乙烯微球提起，并倾斜放置直至水分完全挥发。4.如权利要求1所述的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列，其特征在于：步骤(3)所述的利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜对硅进行刻蚀，包括如下步骤，①减小聚苯乙烯微球的粒径：将表面带有聚苯乙烯微球单层膜的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：O2流量为10～50sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为15～200W，电感耦合等离子体功率为50～150W；刻蚀时间为1～15min，刻蚀后聚苯乙烯微球的粒径减小为80～3500nm.②硅的刻蚀：将减小了聚苯乙烯微球粒径的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：SF6流量为5～15s...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕男，李宁，窦树珍，朱群艳，王中舜，滕飞，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22