利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法技术

本发明专利技术涉及的是一种生物工程技术领域的利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，步骤为：将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸、介导印迹的金属离子和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解到致孔剂中，加入引发剂，封口，将合成的聚合物搅碎后，除去微细的颗粒，通过萃取除去模板分子，将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物；将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中；对固相萃取柱活化和预处理，加入ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］处理后的尿样，经过淋洗固相萃取柱，即洗脱、净化四环素。本发明专利技术具有高选择性、高特异性、耐不良环境和能够直接在水环境中使用的优点。

Method for directly purifying tetracycline in aqueous sample by using molecularly imprinted polymer

The present invention relates to the use of molecularly imprinted polymer is a biological engineering technical field of direct purification method, tetracycline aqueous sample includes template molecule and functional monomer methacrylic acid tetracycline, mediated by imprinted metal ion and crosslinking agent two ethylene glycol methacrylate dissolved into the mixed porogen, adding initiator, sealing, the synthesized polymer blend, remove fine particles by extraction of the template molecules were removed, the removal of the template molecule polymer was dried overnight, tetracycline molecularly imprinted polymer; filling four ring element of molecularly imprinted polymers to solid phase extraction column; solid phase extraction column on activation and pretreatment, adding KH case 2: PO 4 treated samples, after leaching of solid phase extraction column, namely elution and purification of tetracycline. The invention has the advantages of high selectivity, high specificity, adverse environment resistance and direct use in a water environment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物化学工程
的方法，具体的说，是一种利用 分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法。技术背景四环素(Tetracycline,简称TC)属于四环素类抗生素，是一种广泛使用 的人畜共用的药物，常被用于治疗和预防传染性疾病或作为饲料添加剂促进动物 生长。如果使用不当会造成残留。对人，畜，环境造成损伤或污染。长期食用四环 素超标的动物性食品，对人体会产生直接的毒副作用和引起过敏反应。为了保证 人民的身体健康，世界各国，如欧盟、日本、美国和我国农业部,对四环素的使用 和残留都做了严格的规定并制定了相应的标准，其中欧盟对动物性食品及不同组 织中规定的限量不同，如牛奶中最高不能高于100ppm。同时，由于牛奶、血液、 尿液等生物样品及被四环素污染的河水、废水等环境样品中的水含量很高。因此， 开发兼容水环境且灵敏的检测方法，对分析痕量存在的四环素十分必要。由于动 物性食品和环境样品的基质复杂，所以有必要进行前处理，从而提高检测的灵敏 度。目前通用的前处理方法有液液分配、固相萃取、免疫柱层析技术等，其中固 相萃取技术因为操作简单，节约试剂，可同时处理多个样品而得到广泛应用。但 是由于目前常用的固相萃取填料与目标物的吸附作用都是非特异的，固定相的选 择性低，易受复杂基质的干扰，限制了该项技术的发展，分子印迹技术是基于分 子识别基础上的一种功能聚合物制备技术，该聚合物合成时采用目的分子或者类 似物作为模板，合成后将模板洗脱，内部保留和目的分子互补的空间结构和基团， 且具有"记忆"功能，可特异的和模板分子发生作用，并通过相应的方式洗脱， 从而达到纯化和富集目的分子的作用。由于分子印迹聚合物是采用化学方法合成 的，具有抵抗酸碱等恶劣环境的优点，可重复使用，所以应用越来越广泛。不过， 很多用非共价聚合的方法开发出来的分子印迹聚合物在水环境中的兼容性比较低。如何在含水丰富的样品中使用分子印迹聚合物，以便直接净化提取生物和环 境样品中的目标分析物，是分子印迹技术应用研究方面的重要课题。经对现有技术文献的检索发现，R. Suedee等在《Journal of Chromatography B》(2004，811， 191-200)上发表的文章"Use of molecularly imprinted polymers from a mixture of tetracycline and its degradation products to produce affinity membranes for the removal of tetracycline from water"(将四环 素及其降解产物印迹的分子印迹聚合物用于制备亲和性膜)合成了四环素分子印迹聚合物并尝试将其作为亲和膜中的识别材料进行了评价。这项研究首次证明， 以四环素类抗生素作为模板分子制备的分子印迹聚合物，可以从水中特异性的分 离吸附相应的抗生素。但是该文章的印迹聚合物是在不含水的有机溶剂中制备 的，并且只是从理论上探索水溶液中的PH值、离子强度等因素对亲和吸附的影 响，并没有记载合成的材料应用到样品的前处理方面。Yan HY等在《Talemta》 (2008; 75:227-232.)上发表的"Water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine" 中，于甲醇和水的混合物中制备了能从人的尿液中选择性提取喹诺酮类抗生素环丙沙星的分子印迹聚合物。但是该文章介绍的方法依赖于模板抗生素的物理化学 特性，未见适用于其它抗生素分子印迹聚合物的报道。在含水样品中的抗生素检 测和处理方面，到目前为止还没有报道涉及金属离子介导的分子印迹聚合物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用分子印迹聚合物净 化含水样品中四环素的方法，从而弥补在四环素残留的检测过程中，现有的技术 在环境及生物样品前处理方面存在的弊端，简单、快速、特异、高效的纯化和富 集痕量四环素，提高现有检测的灵敏度。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术首先制备四环素分子印迹聚合 物，然后将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子印迹 聚合物固相萃取小柱，在应用四环素分子印迹固相萃取小柱纯化、富集尿液中的 四环素残留。本专利技术包括如下步骤第一步，制备四环素分子印迹聚合物①将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、介导印迹的金属离子和 交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按模板分子金属离子功能单体交 联剂摩尔比=1: 1 5: 2 10: 20，混合溶解到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异 丁氰(AIBN)，混合溶解后，体系置于安培瓶中，充入氮气，然后在氮气气氛下 封口， 60 7(TC热引发聚合反应24 48小时； 所述金属离子为Mg2+， Fe2+, Cij2+中一种。所述四环素和致孔剂的用量为当模板分子为0. lmmol时，致孔剂的体积为 4 7ml。所述致孔剂为甲醇和水的混合溶液，两者体积比为9: 1 3。② 将合成的聚合物搅拌分散后，得到粒径在0.1 1.5um之间的颗粒，除去 微细的颗粒；最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；所述索氏萃取，其条件为萃取剂采用甲醇、醋酸混合液，二者的体积比为 9: 1 8: 2，萃取时间为24 72小时，萃取分三次完成，每次8小时以上；最 后用纯甲醇萃取1 2次，除去剩余的醋酸。③ 将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物。所述干燥，其温度为6(TC。通过以上步骤，获得的分子印迹聚合物为直径在l.Oixm左右的球状颗粒。 在含水丰富的环境中，实验测得该聚合物能特异性吸附四环素，每克聚合物理论 上的最大吸附量为4.1毫克四环素。并且适合用作固相萃取的填料，与已有的 检测方法(如ELISA、 HPLC等)相结合，能够处理含水丰富的生物样品(如尿样)， 并获得较高的回收率。不但有效地净化了基质，而且富集了目标分析物，显著提 高四环素残留的检测灵敏度和检测效率。第二步，将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子 印迹聚合物固相萃取小柱；所述的填充到固相萃取柱管，是指:用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和筛板，称量四环素分子印迹聚合物50mg 150mg，用乙醇匀浆后，填充于商品化的lm1 6 ml聚丙烯固相萃取小柱内。所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空状态下，将匀浆液装入聚丙烯固相萃 取小柱，填料的顶端和底端分别装上聚乙烯筛板。所述的筛板，其孔径为0.5 ym。第三步，先后用乙腈、乙酸、HC1、双蒸水、FeS04对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化预处理，加入KH2P04处理后的尿样，经过淋洗固相萃取柱，即 能洗脱、净化和收集四环素。所述的对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化，是指用5 10ml乙腈、 乙酸、HC1 ， 5 10ml双蒸水，1 2mlFeS04对固相萃取柱预处理，其中乙腈、 乙酸、HC1体积比为8:1:1， HC1浓度为1. 0 mol L—、 FeS04浓度为0. 25腿ol L—1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用分子印迹聚合物直接净化含水样品中四环素的方法，其特征在于，包括如下步骤：　第一步，制备四环素分子印迹聚合物　①将模板分子四环素、功能单体甲基丙烯酸、介导印迹的金属离子和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子∶金属离子∶功能单体∶交联剂摩尔比＝１∶１～５∶２～１０∶２０，混合溶解到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁氰，混合溶解后，体系置于安培瓶中，充入氮气，然后在氮气气氛下封口，６０～７０℃热引发聚合反应，其中金属离子为Ｍｇ↑［２＋］，Ｆｅ↑［２＋］，Ｃｕ↑［２＋］中一种；②，将合成的聚合物搅拌分散后，得到粒径在０．１～１．５μｍ之间的颗粒，除去微细的颗粒，最后通过索氏萃取进一步除去模板分子；　③，将除去模板分子的聚合物干燥过夜，获得四环素的分子印迹聚合物。　第二步，将四环素分子印迹聚合物填充到固相萃取柱管中，得到四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱；　第三步，先后用乙腈、乙酸、ＨＣｌ、双蒸水、ＦｅＳＯ↓［４］对四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱活化预处理，加入ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］处理后的尿样，经过淋洗四环素分子印迹聚合物固相萃取小柱，即能洗脱、净化和收集四环素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张大兵，武爱波，瞿国润，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]