本发明专利技术涉及用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，有效解决海藻糖合酶酶活力的分析工作繁重、操作成本高、样品处理繁琐的问题，用麦芽糖溶液制作成标准曲线，挑取产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种，于发酵产酶培养基中培养，制成发酵液，发酵液加入溶菌酶，离心，上清液与麦芽糖溶液混合，沸水浴使酶失活，上清液分装3支试管，加入3,5‑二硝基水杨酸显色液，测出试验样品麦芽糖含量，制备空白组样品，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，本发明专利技术方法易操作，检测速度快，成本低，效果好，方法稳定可靠、准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，特别是一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法。
技术介绍
海藻糖（trehalose）又称α-D-吡喃葡糖苷基-α-D-吡喃葡糖苷，是一种安全、可靠的天然糖类，海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖可以作为蛋白质、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出：“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”。同时海藻糖安全无公害，作为一种绿色食品添加剂已通过美国和欧盟的认证，而且有很大的市场需求量。在不同生物中，海藻糖生物合成主要有三种途径：1）OtsA-OtsB途径，即以UDP-葡萄糖和6-P-葡萄糖为底物，通过TPS(Trehalose-6-phosphatesynthase，6-磷酸海藻糖合成酶)和TPP(Trehalose-6-phosphatephosphate，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶)两种酶催化合成海藻糖；2）TreY-TreZ途径，即以淀粉为底物，利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyltrehalosesynthase,MTSase,TreY基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalosehydrolase,MTHase,TreZ基因编码）的协同作用，将淀粉转化为海藻糖；3）TreS（Trehalosesynthase，海藻糖合酶）途径，即以麦芽糖为底物，利用菌株内特异的海藻糖合酶分子内转糖基化作用，将麦芽糖转化为α，α-1,1-糖苷键连接而成的海藻糖。海藻糖的各种生产方法，包括微生物酵母抽提法、微生物发酵法、天然生物提取法、酶转化法、化学合成法、基因重组法等，酶法转化海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径，TreS途径海藻糖合酶单酶转化法生产海藻糖，不需要任何辅酶，以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，底物专一性强，工艺简单，易于调控，在工业化生产海藻糖中具有良好的应用前景，适于工业化生产海藻糖，在工业酶法生产海藻糖中最具优势，但仍有许多问题需要研究解决，其中海藻糖合酶是至关重要，而筛选产海藻糖合酶高产菌株关键。目前在TreS途径海藻糖合酶产生菌筛选过程中海藻糖合酶酶活力分析工作繁重，海藻糖合酶酶活力定量检测通过分析产物海藻糖的含量来获得，用于海藻糖合酶酶解麦芽糖产物海藻糖的定量分析方法中，主要借助高效液相色谱（HPLC），高效液相色谱（HPLC）是最理想的方法，能快速、准确测定样品中的海藻糖，但存在设备昂贵等特点（繆静，2004），这些方法的推广不仅受到实验室设备条件的限制，而且对样品的纯度要求高，无法对提取过程中的中间试样品进行测定，并且对于菌种筛选、培养及提取过程中大量的海藻糖快速定性定量测定工作，完全依赖于HPLC并不是一个高效经济的方法，给科研工作带来一定困难（周坚，1997）（毛忠贵，1997）（段峰，2008）。高效液相色谱（HPLC）是最理想的方法，能快速、准确进行定量分析，但存在设备昂贵、操作成本高、样品处理制备比较繁琐等特点，不仅需要昂贵的仪器和试剂，而且在测定前，还需对样品进行多步处理，耗时多，操作繁琐，不适用于海藻糖生产菌的筛选（安宁，2011）（王雷，2004）。寻找一种应用于海藻糖生产菌株的筛选中，能够准确、快捷地检测海藻糖合酶酶活性的方法且设备简单、操作简单易行、费用低、易于海藻糖生产菌种初筛和中间试样的测定，作为海藻糖产生菌筛选及工艺参数确定的常规手段很需要。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，可有效解决TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的分析工作繁重、使用仪器和试剂昂贵、操作成本高、样品处理繁琐的问题。本专利技术解决的技术方案是，包括以下步骤：A、制作标准曲线：将麦芽糖250.00mg，溶于蒸馏水中，制成麦芽糖含量为1mg/mL的麦芽糖溶液，吸取麦芽糖溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分别加入蒸馏水定容至100mL，配制不同浓度的梯度麦芽糖溶液，取6支试管编号为1、2、3、4、5、6，分别吸取梯度麦芽糖溶液2.5mL，各加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温，于540nm波长下比色，记录各管的OD值，以光密度OD值为纵坐标，2.5mL梯度麦芽糖溶液中麦芽糖含量，单位为mg/mL为横坐标，制作成标准曲线；所述的3,5-二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水700mL中，加热，趁热加入3,5-二硝基水杨酸6.3g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却后加蒸馏水定容至1000mL；B、制备待测海藻糖合酶酶液：发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲液振荡洗涤2-3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l（pH7.0）磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；所述的发酵液的制备方法是，在无菌操作下，从产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种挑取2-3环，接种于60mL发酵产酶培养基中，37℃、160r/min摇床振荡培养48h制成；所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麦芽糖10.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏1.0g、K2HPO41.0g、NaH2PO41.0g、MgSO4·7H2O0.5g和蒸馏水1000mL混匀，调节酸碱度至pH7.2制成；C、海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；制备空白组样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制作标准曲线：将麦芽糖250.00mg，溶于蒸馏水中，制成麦芽糖含量为1mg/mL的麦芽糖溶液，吸取麦芽糖溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分别加入蒸馏水定容至100mL，配制不同浓度的梯度麦芽糖溶液，取6支试管编号为1、2、3、4、5、6，分别吸取梯度麦芽糖溶液2.5mL，各加入2.5mL的3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温，于540nm波长下比色，记录各管的OD值，以光密度OD值为纵坐标，2.5mL梯度麦芽糖溶液中麦芽糖含量，单位为mg/mL为横坐标，制作成标准曲线；所述的3,5‑二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水700mL中，加热，趁热加入3,5‑二硝基水杨酸6.3g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却后加蒸馏水定容至1000mL；B、制备待测海藻糖合酶酶液：发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L磷酸缓冲液振荡洗涤2‑3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；所述的发酵液的制备方法是，在无菌操作下，从产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种挑取2‑3环，接种于60mL发酵产酶培养基中，37℃、160r/min摇床振荡培养48h制成；所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麦芽糖10.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏1.0g、K2HPO4 1.0g、NaH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g和蒸馏水1000mL混匀，调节酸碱度至pH7.2制成；C、海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1‑0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；制备空白组样品，测出麦芽糖含量:取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1‑0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL 3,5‑二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；所述的质量浓度5%麦芽糖溶液是由麦芽糖5.000g加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液定容至100mL制成；D、活力测定：海藻糖合酶酶活力定义：在60℃、pH7.0条件下，以质量浓度5%麦芽糖为底物，每克干菌体1h产生1mg海藻糖为1个酶活力单位（U）；空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，实现快速定量检测海藻糖合酶酶活力。...
【技术特征摘要】
1.一种用于细菌TreS途径海藻糖产生菌筛选中快速定量检测海藻糖合酶酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、制作标准曲线：将麦芽糖250.00mg，溶于蒸馏水中，制成麦芽糖含量为1mg/mL的麦芽糖溶液，吸取麦芽糖溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分别加入蒸馏水定容至100mL，配制不同浓度的梯度麦芽糖溶液，取6支试管编号为1、2、3、4、5、6，分别吸取梯度麦芽糖溶液2.5mL，各加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5分钟，冷却至室温，于540nm波长下比色，记录各管的OD值，以光密度OD值为纵坐标，2.5mL梯度麦芽糖溶液中麦芽糖含量，单位为mg/mL为横坐标，制作成标准曲线；所述的3,5-二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水700mL中，加热，趁热加入3,5-二硝基水杨酸6.3g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却后加蒸馏水定容至1000mL；B、制备待测海藻糖合酶酶液：发酵液于4℃、6000r/min离心15min，弃上清液，获得的菌体用0.05mol/L磷酸缓冲液振荡洗涤2-3次，收集湿菌体；称取1.000g湿菌体加入0.05mol/l磷酸缓冲液定容至原发酵液体积，制成菌悬液，每克干菌体加入20000U活力单位的溶菌酶，37℃振荡破壁30min，将破壁后的菌悬液于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，收集上清液即为海藻糖合酶酶液；所述的发酵液的制备方法是，在无菌操作下，从产海藻糖合酶菌株试管斜面菌种挑取2-3环，接种于60mL发酵产酶培养基中，37℃、160r/min摇床振荡培养48h制成；所述的发酵产酶培养基是由重量计的：麦芽糖10.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏1.0g、K2HPO41.0g、NaH2PO41.0g、MgSO4·7H2O0.5g和蒸馏水1000mL混匀，调节酸碱度至pH7.2制成；C、海藻糖合酶酶活力的定量检测，方法是：制备试验样品，测出麦芽糖含量：取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液，与质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL混合，在60℃水浴保温1h，沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出试验样品麦芽糖含量；制备空白组样品，测出麦芽糖含量:取15mm×150mm试管3支，编号(1)、（2）、（3），每管内加入质量浓度5%麦芽糖溶液2.0mL,在60℃水浴保温1h后，再补加入2.0mL待测海藻糖合酶酶液混匀，立即沸水浴10min，使酶失活，以终止反应，12000r/min离心15min，收集上清液，稀释成OD值0.1-0.3的稀释液，然后再取15mm×150mm试管3支，编号1、2、3，每支试管加入稀释液2.5mL，再加入2.5mL3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴煮沸5分钟，冷却至室温后于540nm波长下比色，记录测定各管的OD值，取3支试管OD值的平均值，查标准曲线测出空白组样品麦芽糖含量；所述的质量浓度5%麦芽糖溶液是由麦芽糖5.000g加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液定容至100mL制成；D、活力测定：海藻糖合酶酶活力定义：在60℃、pH7.0条件下，以质量浓度5%麦芽糖为底物，每克干菌体1h产生1mg海藻糖为1个酶活力单位（U）；空白试验查标准曲线得到的麦芽糖含量减去样品试验查标准曲线得到麦芽糖含量，计算得出海藻糖合酶酶活力，实现快速定量检测海藻糖合酶酶活力...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘德海，解复红，权淑静，马焕，巩涛，杨文玲，谢红霞，高爱霞，
申请(专利权)人：河南省科学院生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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