一种能显著抑制口腔癌细胞的中药提取物，属于新型口腔癌中药研发领域。漏芦乙酸乙酯提取物，提取方法简单、快捷，可批量生产。选用CCK8法检测漏芦EA对口腔癌细胞SCC15的增殖抑制作用；FITC/PI流式细胞术检测漏芦EA对SCC15细胞凋亡的影响，western blot检测MAPK信号通路中凋亡相关蛋白的表达；侵袭及划痕实验检测漏芦EA对SCC15细胞侵袭及迁移作用的影响，Q‑PCR和western blot检测上皮间质转化EMT相关基因及蛋白的表达。本发明专利技术为临床治疗口腔癌新药的研发提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种干预口腔鳞状细胞癌细胞生长的药物，具体地说是以中草药漏芦为原料，经乙酸乙酯提取，即漏芦乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EA)。本专利技术还涉及该药物的制备方法。
技术介绍
祁州漏芦(Rhaponticum uniflorum，DC.)多年生草本，根直伸，茎直立，不分枝，簇生或单生，灰白色，被棉毛。生于山地草原、草甸草原、石质山坡。分布黑龙江、吉林、辽宁、河北、内蒙古、陕西、甘肃、青海、山西、河南、四川、山东等地。《本草纲目》上描述其功效：“漏芦，下乳汁、消热毒、排脓、止血、生肌、杀虫，故东垣以为手、足阳明药，而古方治痈疽发背，以漏芦汤为首称也。庞安常《伤寒论》治痈疽及预解时行痘疹热，用漏芦叶，云无则以山栀子代之，亦取其寒能解热，盖不知其能入阳明之故也”。漏芦为较常用中药，早有“久服轻身益气，耳目聪明，不毛延年”的记载。漏芦既以其苦寒通利之性，清泄阳明经之热，又因其益气活血、强健脾胃之功能，故久服可延年益寿。但多年来临床中多取其清热解毒、消痈肿、下乳汁之功效，对其抗肿瘤的作用研究较少。口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤的40％。世界范围内每年有接近540,000例新发病例，尽管近年来口腔癌治疗的技术不断提高，但5年生存率不足50％(1)。在发展中国家，口腔癌成为主要致死性疾病之一。目前，对于口腔癌主要采用手术治疗，放射治疗，化学药物治疗为主的综合序列治疗，但治疗效果往往不佳。理想的抗癌药物应具备低毒、安全、有效、价廉等条件。中药是我国医学瑰宝，现代药理研究表明许多传统中药具有抗肿瘤作用，且具有优效、低毒、低副作用的优点。目前，中药已成为肿瘤预防和治疗新的研究热点。寻找新型低毒高效的治疗药物对口腔癌综合治疗具有重要意义。漏芦始载于《神农本草经》，列为上品。味苦、咸，性寒，入胃，大肠经，具有清热解毒、消痈排脓、通乳功效。研究表明，漏芦挥发油有醇类，酮类，烷烃类，烯类，萜类，酚类等化合物.其中主要为萜类化合物，萜类化合物是存在于植物界的具有多方面生物活性的有意义的一类化合物，是某些中药的有效成分.如上述挥发油中都含有的石竹烯、榄香烯等活性有效成分分别具有镇痉、抗病毒、驱虫等作用(2)。近年来，一些研究表明，漏芦具有抗氧化、提高免疫、抗炎及抗衰老、抗肿瘤等作用(3-6)。其抗肿瘤作用机制可能通过诱导细胞凋亡、逆转耐药细胞株对化疗药的敏感性、抑制肿瘤细胞增殖等作用。相关研究表明，漏芦提取物大剂量时可发挥直接抑瘤抗癌作用。在小剂量时可发挥突出的逆转耐药作用，有助于让已耐药的细胞株对化疗药重获敏感；可有效逆转对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的耐药性，因而在临床上有广阔的应用前景(7-8)。漏芦复方制剂可有效治疗原发性肝癌(9)。在荷瘤动物试验中，漏芦及其复方制剂具有明显的抑制肿瘤作用，其作用可能与其增高机体免疫机能和抗氧化能力有关(10-11)。但目前漏芦对口腔癌作用等方面的研究尚未见报道。研究表明，抑制细胞凋亡相关基因Bcl-2过表达质粒转染上皮细胞后促进EMT相关因子表达(12)。当大鼠胚胎肝细胞发生EMT时，能够促进Akt以及Bcl-xL的活化，进而抑制TGF-β诱导的凋亡，这些细胞具有肝前体细胞以及一些肝细胞瘤的性质。据此推测，EMT的细胞活化了抗凋亡的信号通路(AKT和PI3K)或者分泌了抗凋亡的因子。多种不同的哺乳动物上皮细胞(EpH-4、NMuMG和KIM-2)在经诱导发生EMT之后，对紫外线照射诱导的凋亡具有明显的耐受性(13)。本研究发现漏芦EA抑制SCC15细胞增殖，且随时间增加抑制作用增强；可显著诱导SCC15细胞凋亡，并且具有时间和浓度依赖性；漏芦EA抑制SCC15细胞侵袭及迁移；并具有逆转口腔癌细胞SCC15上皮间质转化的作用。漏芦EA导致促凋亡相关的p-p38和p-JNK表达显著增高，使促增殖相关的p-ERK表达降低。漏芦EA影响EMT进程，从而抑制口腔癌生长、侵袭及迁移。参考文献(1)傅锦业，高静，郑家伟，等.口腔癌相关危险因素的流行病学调查分析.中国口腔颌面外科杂志，2011,9(4)：316-322.(2)高玉国，许尧舜.漏芦挥发油成分分析.鞍山师范学院学报,2013,15(2):38-40.(3)左巍，左伟，关欣，等.祁州漏芦在成人原发性肾病综合征中的降脂作用.中国自然医学杂志，2001.3(1)：27—28.(4)全吉华，金延华，尹学哲,等.漏芦醇提取物的体外抗氧化作用.中国实验方剂杂志，2011,17(6)：197-199.(5)朴龙，张学武，金香子，等.漏芦提取物抗衰老作用的研究.时珍国医国药,2006,17(10):1918-1919.(6)包小妹，罗素琴,等.祁州漏芦化学成分和药理学研究进展.亚太传统医学，2011,7(9):176-177.(7)焦中华，刘培民，李秀荣，等.漏芦抽提剂(RHU)含药血清对人乳腺癌耐药株MCF-7/ADR细胞P170蛋白表达的研究.光明中医，2008，18(108):17-18.(8)曹芳，李秀荣.漏芦抽提剂对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的耐药逆转作用研究.山东中医杂志，2009，28(6):415-417.(9)王会仓，王秀明.复方漏芦汤治疗原发性肝癌30例临床观察.湖南中医杂志，2008，24(1)：26-27.(10)高颖，吴眉，唐苾芯，等.吴氏消瘤散对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用.中成药，2014,26(3)：446-450.(11)金爱花，许惠仙，刘文静，等.祁州漏芦对H22小鼠肝癌皮下移植瘤的抑瘤作用及其机制初探.2011,17(5)：165-167.(12)An J,Lv J,Li A,Qiao J,et al.Constitutive expression of Bcl-2 induces epithelial-Mesenchymal transition in mammary epithelial cells.BMC Cancer.2015 Jun 20；15:476.(13)RobsonH，Khaled WT，AbellKW，et a1.Epithelial-to-ruesenchymal transition confers resistance to apoptosis in three murine mammary epithelial cell lines.Diferentiation，2006，74(5)：254—64.现有技术背景缺陷：口腔癌主要采用手术治疗，放射治疗，化学药物治疗为主的综合序列治疗，但治疗效果往往不佳。现代药理研究表明许多传统中药具有抗肿瘤作用，且具有优效、低毒、低副作用的优点。人们开始逐步重视于传统中药的开发，寻找新型低毒高效的治疗药物对口腔癌综合治疗具有重要意义。本实验所用提取溶剂为脂溶性溶剂乙酸乙酯，较常规的水提物更能够较充分的溶解漏芦中的有效物质。本专利技术为临床治疗口腔癌新药的研发提供依据。
技术实现思路
本专利技术目的是根据漏芦抗氧化，调高免疫，抗肿瘤等直接或间接的抗肿瘤作用，来检测漏芦乙酸乙酯提取物是否具有抗口腔癌作用，以期为口腔癌的临床药物治疗提供新的支持。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下。具体包括以下步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种漏芦的提取物，该提取物为乙酸乙酯，对口腔癌生长的干预作用。
【技术特征摘要】
2015.11.13 CN 20151078174081.一种漏芦的提取物，该提取物为乙酸乙酯，对口腔癌生长的干预作用。2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述漏芦的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：漏芦用石油醚浸泡18-36h，渗滤提取至3-8倍药材量，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，用70％-90％乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浓缩液，相对密度为1.15-1.20，用乙酸乙酯萃取，倒出上层，即得乙酸乙酯提取物。3.根据权利1所述的对口腔癌的干预作用，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)首先CCK-8法检测漏芦乙酸乙酯对口腔癌细胞SCC15的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。(2)流式细胞仪检测漏芦...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤晓飞，王春晓，陈慧，张敏，黄林芳，连增林，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京口腔医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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