本发明专利技术涉及一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法。本发明专利技术涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺，其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪传染性胃肠炎病毒的大规模培养，具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus of Swine，TGEV)属冠状病毒科冠状病毒属成员，可导致猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)。该病是猪的一种急性高度接触性传染病(Saifetal.，1992)，临床特征为腹泻、严重呕吐和脱水。不同年龄和品种的猪对本病均易感，潜伏期短，传播快，2～3天内可波及猪群。该病对新生仔猪具有高度致死率，两周龄以内的仔猪发病率和致死率可达100％，现已成为猪的一种世界性疾病。我国从60年代起就有TGE的报道，近年来，TGE在我国部分地区时有发生和流行，在猪群密集的地区，TGE是仔猪发病和死亡的主要原因之一，给养猪业带来了严重的危害。猪场一旦感染TGEV很难根除，目前只能依靠疫苗预防控制。ST细胞，即猪睾丸细胞，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养，该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等，是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法，优势是工艺简单、成本低廉，然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决(陈文庆,王建超,刘华杰等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析.中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。基于转瓶培养的弊端，悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小、成本低等优点，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面，率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应，疫苗生产企业越来越关注新工艺。本专利技术所述传代细胞全悬浮生产猪传染性胃肠炎疫苗的工艺。其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后，可用于猪传染性胃肠炎病毒的培养。较其它微载体悬浮培养系统，该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪传染性胃肠炎疫苗的工艺，从而降低生产成本，进行规模化、均一性生产，以应对目前国内猪传染性胃肠炎病的流行形势。本专利技术的技术方案1.一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪传染性胃肠炎病毒。3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述方法具体为：(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液，并接种0.1％～0.5％(V/V)猪传染性胃肠炎病毒种毒；(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待80％左右的细胞出现典型CPE时，收获病毒液，加入适宜的耐热冻干保护剂混匀后分装、经冷冻真空干燥制成疫苗。4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述的病毒为保藏号为CGMCC No.6001的猪传染性胃肠炎病毒SD/L株。5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述ST细胞株的建立，是由猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养液悬浮驯化过程而获得，该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(Swine Testis)悬浮适应株(简称ST-1株)，该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12698。以上本专利技术所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液，其血清含量(V/V)为：0.5％～2％。使用的生物反应器为APPLIKON公司30L～2000L细胞生物反应器。本专利技术公开的ST细胞全悬浮培养猪传染性胃肠炎疫苗的工艺，其操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体，可以在低血清培养液中悬浮培养，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。具体实施方式1.全悬浮培养的ST细胞株的建立驯化过程(1)ST细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)从液氮罐中取ST(CVCC，No.CL27,《中国兽医菌种目录》(第二版)，p171)贴壁细胞种子，在T75培养瓶中加入10％新生牛血清的细胞生长液，进行ST细胞复苏，并贴壁培养，使用逐步降低血清的贴壁培养液进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。(2)ST细胞(低血清培养液)的悬浮驯化将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2.0％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳定增值到1.2×106/ml，细胞活力达到90％以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化，确定了pH7.0±0.1、转速120r/min，实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养，并对生物反应器中的溶氧量进行了改进，从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程，并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系(Swine Testis)悬浮适应株，简称ST-1株，该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCC No.12698。(详见实施例1)2.全悬浮细胞的制备(1)细胞摇瓶扩大培养：细胞复苏后以5×105/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至1.2×106/ml时，进行传代，按照比例补加新鲜培养基，使细胞初始密度为5×105/ml。(2)细胞接种：细胞接种前本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。
【技术特征摘要】
1.一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪传染性胃肠炎病毒。3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法，其特征在于所述方法具体为：(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的...
【专利技术属性】
技术研发人员：禚宝山，魏联果，李营，张广，董海曼，周忠涛，孙旭燕，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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