猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂制备方法技术

本发明专利技术涉及猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂制备方法。本发明专利技术属于生物制药技术领域。本发明专利技术包括ＴＧＥＶ单抗制备、中药提取液制备、ＴＧＥＶ单抗与中药提取液合成工艺过程。将石蜡油注入小鼠腹腔，６－９天注入杂交瘤细胞，７－１５天抽取腹水，２５００－３５００ｒｐｍ离心８－１２ｍｉｎ，得到上清液ＴＧＥＶ单抗。将板蓝根粉１份加水８－１２份，浸泡７－１５小时，５０－７０℃水浴８－１２分钟，滤液６０－７０℃负压７－８千帕浓缩，加入乙醇达７０－９０％，上清液为中药提取液。ＴＧＥＶ单抗与中药提取液按体积比１∶０．８－１．２混合得产品。本发明专利技术属纯天然、无药残、无耐药性、无毒副作用抗感染药物，效果明显。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，是关于一种。
技术介绍
由于猪传染性胃肠炎病毒免疫原性较弱，培养比较困难，所以抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的研制较难。虽然有成功研制抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的报道，但研制的抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体没有中和病毒的活性，不能用于临床治疗。目前，还没有将猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体制成免疫生物制剂在临床上用于预防和治疗猪传染性胃肠炎的报道。
技术实现思路
本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题，而提供了一种。本专利技术的目的是提供一种工艺简单，临床上对猪传染性胃肠炎有良好预防和治疗效果的。1.分泌抗TGEV单抗杂交瘤细胞株的建立采用纯化的TGEV抗原免疫3只7周龄BALB/C小鼠，免疫剂量为每次100ug/只小鼠。将抗原与等量弗氏完全佐剂充分混合成乳状，腹腔注射首免，2周后，将抗原与等量弗氏不完全佐剂充分混匀，同法再注射一次二免；细胞融合前3d，尾静脉注射不含佐剂抗原加强免疫。取免疫鼠，摘除眼球放血后拉颈处死，浸泡于75％的酒精中5min，无菌取出脾脏并剥除周围结缔组织，将脾脏置于200目铜网上，用注射器内心轻轻挤压后，用无血清DMEM培养液轻轻吹打，收集脾细胞悬液，200r/min离心5min，弃上清液，用无血清DMEM培养液悬浮后，制成脾细胞悬液。取上述制备的脾细胞悬液和SP2/O细胞悬液，按细胞数之比5∶1充分混合，1000r/min离心3min，将上清夜尽量弃去，然后用手指轻弹管底，使沉淀细胞松散成糊状，置37℃水浴中，在60S内缓缓加入0.7ml 50％的PEG(M1500)，同时轻轻转动离心管，在30S内将细胞悬液缓缓吸入管内，静置30S，再在30S内将细胞悬液缓缓吹回至离心管内。立即在2min内，缓缓加入适量无血清DMEM培养液，轻轻悬起细胞，500r/min离心5min，弃上清，加入20ml DMEM-HAT以悬浮细胞。从CO2培养箱中取出已加好饲养细胞的2块培养板；每孔加入100ul融合细胞悬液，放入37℃，饱和湿度，含5％CO2的培养箱中培养，每天观察细胞生长情况。第5d用HAT培养液半量换液，第10d改用HT培养液。当融合细胞生长至覆盖培养孔1/2-1/3大小时，吸取上清夜作间接ELISA检测，以大于阴性对照孔OD值2倍的孔判为阳性孔。从阳性孔中挑选出OD值高，细胞生长旺盛的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法进行克隆化。待细胞长成克隆后，取上清液做抗体ELISA检测，筛选出仅有一个克隆生长的阳性孔内的杂交瘤细胞再克隆化，反复3次，获得1株能稳定分泌抗TGEV单抗的杂交瘤细胞株，编号为2D6，收获后冻存备用。2.抗TGEV的单抗制备(1)体外培养法将已建株的杂交瘤细胞扩大培养，待细胞浓度达到105/ml以上时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。收集培养液离心，上清液4℃保存备用。(2)体内诱生腹水法将0.5mL的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，一周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔。7～10天后，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将腹水3000rpm离心10min，上清分装，-20℃保存备用。3.中药提取液的制备选用对TGEV有较强抑制作用的中药板蓝根，采用水提醇沉法制备提取液。将板蓝根研磨，取其药末1份于三角烧瓶中，加入蒸馏水10份，在室温中浸泡过夜后，置于60℃的水浴中加热10分钟，立即过滤，其滤液混合减压浓缩(温度60-70℃，负压7-8千帕)，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到80％，以除去蛋白质、多糖和无机盐类等杂质，上清液即为提取液。1ml提取液相当于原生药1g。提取液喷雾干燥成粉剂，保存备用，用前稀释恢复原体积。4.抗TGEV单克隆抗体免疫生物制剂的制备取一定量抗TGEV单克隆抗体腹水，溶解中药粉剂，使其恢复为原体积，并加入寡果糖，使其终浓度达到10％，此即为抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物口服剂。为便于保存，可制成冻干制剂，或喷雾干燥剂，用前稀释恢复原体积。本专利技术采取如下技术方案，包括病毒克隆抗体制备和中药提取液制备过程，其特点是制备方法包括猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体制备、中药提取液的制备、猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液合成工艺过程猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备采用体内诱生腹水法将0.3-0.7ml的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，6-9天注入105-107个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，7-15天，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将腹水在2500-3500rpm离心8-12min，得到上清液猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体。中药提取液选用中药板蓝根采用水提醇沉法制备；将板蓝根研磨，取其药末1份，加入蒸馏水8-12份，浸泡7-15小时，置于50-70℃的水浴中加热8-12分钟，过滤，滤液在60-70℃、负压7-8千帕条件减压浓缩，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到70-90％，上清液即为提取液。猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液合成工艺过程猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液按体积比1∶0.8-1.2混合制得猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂。本专利技术还可以采用如下技术措施所述的，其特点是中药提取液制成冻干制剂或喷雾干燥成粉剂。所述的，其特点是猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体溶解中药粉剂，使其恢复为原体积，并加入寡果糖，使其浓度达到8-12％，得到猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体生物制剂口服剂。所述的，其特点是-10℃至-20℃保存2年以上，制成冻干制剂或喷雾干燥成粉剂可长期保存。本专利技术具有的优点和积极效果 本专利技术抗TGEV单克隆抗体免疫生物制剂，融合了具有中和病毒活性的McAb和对TGEV有较强抗吸附和直接灭活作用的中药板蓝根及免疫增强因子，大大增强了仔猪抗TGEV感染的保护作用和对TGE病猪的治疗作用，是预防和治疗TGE感染的一个全新高效药品，是一种纯天然、无药残、无公害、无耐药性、无毒副作用的环保型绿色抗感染药物，克服了现有抗生素及人工合成化学药品的毒性作用和耐药性。其中的中药有效成分除了自身具备的对病毒灭活和抗吸附作用外，对制剂中的免疫球蛋白具有良好的保护作用，使其口服后通过胃内容时免受胃酸的破坏。将抗体、中药和免疫增强剂结合在一起用于防治TGEV感染，具有显著的优点和明显效果。本专利技术制备的抗TGEV免疫生物制剂，既可口服，又可注射，可大大减低仔猪TGE的发病率和死亡率，具有明显的经济效益和社会效益。具体实施例方式为能进一步了解本专利技术的内容、特点及功效，兹例举以下实施例进行详细说明，包括猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体制备、中药提取液的制备、猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液合成工艺过程猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备采用体内诱生腹水法。将0.5ml的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，一周后天注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔。7-10天，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将腹水在3000rpm离心10min，得到上清液猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体。上清分装，-20℃保存备用。中药提取液的制备选用对TGEV有较强抑制作用的中药板蓝根，采用水提醇沉法制备提取液。将板蓝根研磨，取其药末1份于三角烧瓶中，加入蒸馏水10份，在室温中浸泡过夜后，置于60℃的水浴中加热10分钟，立即过滤，其滤液混合减压浓缩(温度60-70℃，负压7-8千帕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂制备方法，包括病毒克隆抗体制备和中药提取液制备过程，其特征是：制备方法包括猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体制备、中药提取液的制备、猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液合成工艺过程；猪传染性 胃肠炎病毒单克隆抗体的制备采用体内诱生腹水法：将０．３－０．７ｍｌ的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，６－９天注入１０↑［５］－１０↑［７］个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，７－１５天，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将腹水在２５００－３５００ｒｐｍ离心８－１２ｍｉｎ，得到上清液猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体；中药提取液选用中药板蓝根采用水提醇沉法制备；将板蓝根研磨，取其药末１份，加入蒸馏水８－１２份，浸泡７－１５小时，置于５０－７０℃的水浴中加热８－１２分钟，过滤，滤液在６０－７０ ℃、负压７－８千帕条件减压浓缩，浓缩液加入乙醇，使含醇量达到７０－９０％，上清液即为提取液；猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液合成工艺过程：猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体与中药提取液按体积比１∶０．８－１．２混合制得猪传染性胃肠 炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨百亮，冯利，赵翠萍，孙东波，段县平，张建斌，焦小丽，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]