一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用制造技术

本发明专利技术涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用本发明专利技术以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测定了褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的活性，发现褐藻多糖硫酸酯可显著增加NO及TNF‑α、COX‑2等多种细胞因子的表达，并从基因和蛋白水平了解到其机理，有望开发成为一种新型的免疫增强剂，尤其是作为免疫佐剂的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋生物
，具体讲是一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。
技术介绍
免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。随着免疫学研究的不断深入，开发高效、稳定、安全的免疫增强剂越来越受到人们的重视。巨噬细胞是调节机体固有免疫和适应性免疫反应重要的抗原递呈细胞，在宿主对病原菌感染的防御系统中扮演着重要角色，被刺激后可产生不同的炎性介质、细胞因子等，从而抵抗病原菌。因而本专利技术以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测量NO表达量，并从mRNA和蛋白表达水平上测定iNOS、TNF-α、COX-2等细胞因子的表达量，为褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用提供参考依据。褐藻多糖硫酸酯是存在于所有褐藻中的细胞间多糖，又称褐藻糖胶，其成分复杂，具有抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等多种活性，许多生物学效应都与它的化学组分特别是硫酸根含量密切相关。本专利技术所用的褐藻多糖硫酸酯具有良好的水溶性，因而应用更加方便。以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，测定其免疫指标及机理，从而为开发新的免疫增强剂提供可靠的依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。所述褐藻多糖硫酸酯为按照常规的提取方式从褐藻中提取获得。褐藻为海带、裙带菜等。所述褐藻多糖硫酸酯分子量为2000-15000Da。用经灭菌超纯水溶解的所述褐藻多糖硫酸酯，得褐藻多糖硫酸酯水溶液。所述褐藻多糖硫酸酯水溶液浓度为50-200ug/mL。以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测定利用褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的活性：1)不同浓度的褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞NO表达量的影响取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做阳性对照，终浓度为1ug/mL，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积的Griess试剂，室温避光放置10min，酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求出NO量。2)褐藻多糖硫酸酯细胞毒性评价取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯各100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，以LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，弃去旧的培养基，然后每孔加入100uL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液。放入培养箱中培养4小时后，每孔加入100uL的stopping buffer，继续培养18小时，取出用酶联免疫检测仪于550nm测OD值。3)褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞细胞因子表达量的影响：取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的壳聚糖硫酸酯100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。同时设置LPS阳性对照组，终浓度为1ug/ml，3个复孔。将96孔板继续培养24h后，收集细胞上清液，按照相应ELISA试剂盒说明测定细胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。4)褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于六孔板中，细胞接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入褐藻多糖硫酸酯，使其终浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中，提取RNA，并测定提取的RNA量，变性后跑琼脂糖凝胶电泳并拍照保存。然后进行逆转录反应，并用PCR仪扩增。将扩增后的产物进行电泳检测并拍照保存。5)处于对数生长期的褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子蛋白表达量的影响将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，除空白对照外，每孔加入壳聚糖硫酸酯，使其终浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中，每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震荡，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为蛋白提取液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。煮沸变性后，以每孔40μg的核蛋白点样，10％SDS-PAGE分离。通过电转仪将凝胶上蛋白样品移至PVDF膜上，分别与一抗和辣根过氧化氢酶标记的二抗孵育，洗膜后加入发光剂和稳定剂，曝光拍照。经上述测定可见褐藻多糖硫酸酯能够明显促进RAW264.7细胞产生NO，且具有剂量依赖性。褐藻多糖硫酸酯可显著增加RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。褐藻多糖硫酸酯可促进TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表达，且随着时间的延长，呈先上升后下降趋势。褐藻多糖硫酸酯可促进TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表达，且随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。本专利技术所具有的优点：本专利技术所用褐藻多糖硫酸酯为海带、裙带菜等褐藻的提取物，原料天然无毒，且水溶性好，无细胞毒性。本专利技术充分利用了海藻资源，提高其附加值和综合利用水平，经济效益显著。本专利技术以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，通过产生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2等细胞因子的多少，可快速、准确地判断免疫活性强弱并了解其机理，且可检测是否有细胞毒性，为新型免疫增强剂的开发提供依据。附图说明图1为褐藻多糖硫酸酯经高效液相色谱图测得分子量图。图2为褐藻多糖硫酸酯对于TNF-α等细胞因子在基因水平上表达量的影响图。图3为褐藻多糖硫酸酯对TNF-α等细胞因子在蛋白水平上表达量的影响图。具体实施方式本专利技术的实施例结合附图进一步说明如下。下述实施例褐藻多糖硫酸酯，可按照常规的提取方式从海带、裙带菜等褐藻中提取获得。提取参考文献为：Jing Wang,Quanbin Zhang,Zhongshan Zhang,Zhien Li.Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica.Inte本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。

【技术特征摘要】
1.一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。2.按权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯为在褐藻中提取获得。3.按权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于:所述褐藻多糖硫酸酯分子量为2000-15000Da。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏程，杨悦，邢荣娥，于华华，刘松，陈晓琳，李克成，秦玉坤，李荣峰，王雪琴，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37