一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，包括：(1)从芸薹属新种质上取从心叶往外的第三片叶，装入含有钢珠的离心管中，向离心管中加入提取缓冲液，在‑20～‑10℃下静置5～20min后放入磨样机中进行磨样；(2)将磨碎后的叶片用滤网过滤得滤液，在滤液中加入RNAse溶液，在37℃中孵化20～30min；(3)在孵化后的滤液中加入染色液避光染色得单细胞悬浮液样品；(4)用流式细胞仪对单细胞悬浮液样品进行检测。本发明专利技术采用磨样机对叶片组织进行研磨，产生的单细胞悬浮液中单细胞数量较多，很少产生破碎细胞，同时检测效率高，适合大批量检测。

A method for rapid detection of Brassica germplasm was six times as much as the new times of

The invention discloses a method for rapid detection of Brassica was six times as much as the times of new germplasm including: (1) a new germplasm from the leaves to third leaves from Brassica, packed in steel tube centrifugal, centrifugal tube extraction buffer to join in 20 ~ 10 C standing for 5 ~ 20min in grinding machine for grinding samples; (2) the leaves after grinding with the filter filtrate, RNAse solution is added into the filtrate, at 37 DEG C in hatch 20 ~ 30min; (3) adding staining light staining to single cell suspension samples after hatching the filtrate; (4) to detect the single cell suspension samples by flow cytometry. The invention adopts the grinding machine to grind the blade tissue, and the number of single cells in the single cell suspension is more, and the broken cells are rarely produced.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法。
技术介绍
芸薹属(Brassica spp.)是十字花科(Brassicaceae，曾名Cruciferae)植物中最为重要的一个属。在我国，芸薹属作物的种植非常广泛，包括许多重要的蔬菜、油料、药用及饲料作物。很多植物多倍化后由于多个染色体组的累积效应使其表现出许多新的表型，更适合农业生产上的需要，如小麦、棉花、烟草、苹果等。芸薹属A、B、C三个基因组被认为是起源于一个古老六倍体的祖先(参考文献：Lysak M A，et al.Chromosome triplication found across the tribe Brassiceae[J].Genome Research，2005，15：516-525)。然而在自然界中，不存在含有A、B和C三个基因组的六倍体芸薹属植物(AABBCC)，Geng X X等人在文献(参考文献：Geng XX，et al.Doubled haploids of novel trigenomic Brassica derived from various interspecific crosses[J].Plant Cell Tiss Organ Cult，2013，113：501-511)中采用小孢子培养的方法构建了芸薹属六倍体种质的DH系。为了得到稳定的芸薹属六倍体新材料，连续两年对这些材料进行自交，一些材料在自交过程中发生退化，倍性发生改变。有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用这些芸薹属新种质的基础。芸薹属植物从苗期到开花期，没有明显的形态学性状可用于区分不同的倍性水平。因此长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性。主要方法有根尖染色体计数法、子房染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法等。染色体计数法虽然准确性高，但是操作费时，而且技术难度大。流式细胞术是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选的一门新技术，其原理是将悬浮在液流中的单细胞逐个通过测量区，用仪器检测细胞的光学参数而达到快速、大量地测定细胞的一系列物理和生化特性。用流式细胞分析仪检测每个细胞核荧光信号强度，并经仪器自动分析(参考文献：Cousin A，Nelson M.Twinned microspore-derived embryos of canola(Brassica napus L.)are genetically identical[J].Plant Cell Rep，2009，28：831-835.)。DNA含量与荧光信号强度成正比关系。细胞核的倍性最后以C值表示，1C表示细胞核单倍体，2C表示细胞核二倍体，依次类推。利用流式细胞分析仪的特点是快速、简便、准确。准备好的细胞核样品在数分钟内即可完成测定和分析，所以特别适合于样品较多的倍性检测分析，加速育种进程。影响流式细胞术分析成败的关键因素之一是样品制备质量。用于流式细胞仪分析的样品必须是单细胞悬浮液。样品制备过程中发生细胞粘连、团块及细胞重叠等都严重影响检出率和分析结果的准确性。如何快速制备高质量的单细胞悬浮液、建立高效的多倍体检测体系具有重要的应用价值。许多研究者采用流式细胞术对不同植物的倍性进行了研究，并对影响倍性检测的诸多因素进行了研究，包括取样时期、样品大小、细胞分离等。前人对制备样品的描述太过模糊，一般表述为取幼嫩叶片，但是具体在什么阶段多嫩的叶片并没有表达清楚，同时非常幼嫩的叶片(如心叶)效果并不好；同时前人往往用刀片切碎组织样品制备单细胞悬浮液，但是此方法非常费时，不适合大批量检测。因此需要建立一套简单有效的方法来检测芸薹属六倍体新种质的倍性，加速育种进程。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，该方法不仅可以获得大量单细胞、很少产生碎细胞，同时峰带明显、容易判断植株的倍性，大大提高了鉴定效率。一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，包括：(1)从芸薹属新种质上取从心叶往外的第三片叶，装入含有钢珠的离心管中，向离心管中加入提取缓冲液，在-20～-10℃下静置5～10min后放入磨样机中进行磨样；(2)将磨碎后的叶片用滤网过滤得到滤液，在滤液中加入RNAse溶液，在37℃中孵化20～30min；(3)在孵化后的滤液中加入染色液避光染色得单细胞悬浮液样品；(4)用流式细胞仪对单细胞悬浮液样品进行检测。现有技术中常采用刀片处理叶片组织。单面刀片较粗，会破坏细胞结构，产生较多碎细胞，对之后的检测产生干扰；双面刀片虽然比较锋利，产生的碎细胞不多，但是用双面刀片处理叶片组织时比较费时，不适合大批量检测。本专利技术采用磨样机对叶片组织进行研磨，产生的单细胞悬浮液中单细胞数量较多，很少产生破碎细胞，同时检测效率高，适合大批量检测。作为优选，从芸薹属新材料上取叶片时，取叶时期为四至六叶期。若所取叶片较小时，不能分离出足够数量的单细胞，同时不能形成稳定的峰，检测效果较差；使用较嫩或较老的叶片进行测试时，测试结果效果均较差。进一步优选的，从芸薹属新材料上取叶片时，取叶时期为五叶期。磨样前，先将叶片在提取缓冲液中静置5～10min，最优选的静置时间为10分钟，静置后再进行磨样，细胞可以很好的被分散。提取缓冲液包括以下组分：15mmol/L的Tris-HCl、80mmol/L的KCl、20mmol/L的NaCl、20mmol/L的EDTA-Na2、15mmol/L的巯基乙醇、体积百分比浓度为0.05％的TritonX-100。作为优选，每1mg叶片加入8～12μL提取缓冲液。若所加的提取缓冲液过多，则影响滤液中单细胞的浓度，影响检测效果，若所加的提取缓冲液过少则会影响磨样效果，使叶片研磨不充分，细胞分散效果差。作为优选，磨样时，磨样机的振动频率为20～30Hz，磨样时间为20s～4min。叶片的研磨时间非常重要，如果时间过短，细胞无法分散出来；如果研磨时间太长，叶片则会被过度研磨，产生碎细胞较多，干扰后面的检测，造成较大误差。进一步优选的，磨样时，磨样机的振动频率为20～30Hz，磨样机正转12s～2min，反转12s～2min。再优选的，磨样时，磨样机的振动频率为20～25Hz，磨样机正转0.5～1.5min，反转0.5～1.5min。作为优选，磨样机的振动频率为20～25Hz，磨样机正转1min，反转1min。作为优选，步骤(1)中的操作均在冰上进行。以防止温度较高时，样品发生降解。叶片研磨后用300目滤网过滤，得到滤液，在滤液中加入RNAse溶液，在37℃中孵化20～30min。作为优选，RNAse溶液的浓度为3mg/mL。在孵化后滤液中加入染色液避光染色得单细胞核悬浮液样品，作为优选，染色液包括以下组分：0.01mol/L的PBS缓冲液、50μL/mL的碘化丙啶，120μL滤液中加入300μL染色液进行染色。将单细胞悬浮液样品用流式细胞仪进行检测。本专利技术采用美国BD Science公司生产的BD FACSCalibur Flow Cytometer进行倍性检测。其激发光源为488nm氩离子空冷激光；染色的DNA分子经激光激发后促发荧光，检测器测定荧光强度，通过光电倍增管将光信号转变为电信号，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，包括：(1)从芸薹属新种质上取从心叶往外的第三片叶，装入含有钢珠的离心管中，向离心管中加入提取缓冲液，在‑20～‑10℃下静置5～10min后放入磨样机中进行磨样；(2)将磨碎后的叶片用滤网过滤得滤液，在滤液中加入RNAse溶液，在37℃中孵化20～30min；(3)在孵化后的滤液中加入染色液避光染色得单细胞悬浮液样品；(4)用流式细胞仪对单细胞悬浮液样品进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，包括：(1)从芸薹属新种质上取从心叶往外的第三片叶，装入含有钢珠的离心管中，向离心管中加入提取缓冲液，在-20～-10℃下静置5～10min后放入磨样机中进行磨样；(2)将磨碎后的叶片用滤网过滤得滤液，在滤液中加入RNAse溶液，在37℃中孵化20～30min；(3)在孵化后的滤液中加入染色液避光染色得单细胞悬浮液样品；(4)用流式细胞仪对单细胞悬浮液样品进行检测。2.根据权利要求1所述的快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，从芸薹属新种质上取叶片时，取叶时期为四至六叶期。3.根据权利要求2所述的快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，从芸薹属新种质上取叶片时，取叶时期为五叶期。4.根据权利要求1所述的快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，步骤(1)中，每1mg叶片加入8～12μL提取缓冲液。5.根据权利要求1所述的快速检测芸薹属六倍体新种质倍性的方法，其特征在于，磨样时，磨样机的振动频率为20～30Hz，磨样时间为20s～4min。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，周伟军，张康妮，许玲，王尖，葛常青，徐建祥，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33