二硫键连接的可逆终止子制造技术

本发明专利技术提供了对多核苷酸进行测序的方法以及可用于多核苷酸测序的化合物、组合物。所述化学化合物包含：核苷酸及其类似物，其具有包含对3’‑OH基团加帽的可切割化学基团的糖部分，以及通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基，该可切割连接体包含二硫键。另外，所述二硫键和所述可切割化学基团均可被化学试剂切割。此外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与核苷酸的碱基连接的游离巯基基团。

【技术实现步骤摘要】
交叉引用本申请要求于2015年5月8日提交的美国临时专利申请号62/159,017的权益，该申请通过引用全文并入本文。
技术介绍
通常被称为新一代测序(NGS)技术的新测序方法已有望通过测序提供快速、廉价且准确的基因组信息。例如，高通量NGS(HT-NGS)法可以使科学家以较快的速度和较低的成本获得所需的基因序列。然而，有时HT-NGS的效率是以牺牲测序结果的准确性为代价获得的。在这种情况下，合成测序(SBS)方法可以允许更准确地确定掺入的碱基的身份，由此在HT-NGS中提供更高的保真度。SBS方法的一个关键步骤是在已经在链中的最后的核苷酸的3’-OH位置放置可去除的帽。因此，在其3’-OH位置具有可去除的帽的标记的核苷酸的合成对于SBS技术是有意义的。
技术实现思路
本专利技术提供了包含可逆终止子分子即核苷和核苷酸类似物的化学化合物，该核苷和核苷酸类似物具有与该核苷酸糖部分的3'羟基共价连接的可切割化学基团。此外，所述可逆终止子分子包含通过可切割连接体与核苷酸的碱基附接的可检测标记物。该可切割连接体包含二硫键，该二硫键可在化学试剂切割该核苷酸糖部分的3'羟基上的可切割化学基团的同时被相同的化学试剂切割。与3'羟基连接的共价键是可逆的，这意味着该可切割化学基团可通过化学和/或酶促过程去除。该可检测标记物可任选地是可猝灭的。该核苷酸类似物可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸分子和类似物及其衍生物。共价结合的可切割化学基团的存在被设计用于阻碍在基于酶的多核苷酸合成方法中使用的聚合酶的行进。本专利技术的一个方面提供了一种核苷5’-三磷酸类似物，其具有1)糖部分，该糖部分包含对该糖的3’-OH基团加帽的可切割化学基团，以及2)通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基。所述可切割连接体包含二硫键。所述二硫键和对糖的3’-OH基团加帽的可切割化学基团均可被化学试剂切割。此外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述碱基连接的游离巯基基团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基为嘌呤或嘧啶。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的可检测标记物为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物的糖部分为2-脱氧核糖。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割所述核苷5’-三磷酸类似物的化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割所述核苷类似物的化学试剂为三(2-羧乙基)膦。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核苷5’-三磷酸类似物为式(I)或其盐和/或质子化形式：其中：X为O、S或BH3；w为1、2、3、4或5；B为任选取代的杂环核酸碱基或其类似物；L1为第一连接基团，且L1的长度为3-25个原子；L2为第二连接基团，且L2的长度为3-4个原子；L3为第三连接基团，且L3的长度为4-47个原子；且D1为所述可检测标记物。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：L1为n为0或1；R1为R2为p为0-3，q为0-12，r为1-3；且Z为O或NH。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：L2为且m为2或3。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：L3为Q独立地选自不存在、且R3和R4独立地为p为0-3，q为0-12，r为1-3。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：B选自Y为CH或N。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：w为1；X为O；L1为L2为L3为R4为p为0-3，q为0-12，r为1-3；且Q选自不存在、在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)的核苷5’-三磷酸类似物进一步定义为：w为1；X为O；L1为L2为L3为R4为p为0-3，q为0-12，r为1-3；且Q选自不存在、在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的B选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的B为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。在本文提供的方面的一些实施方案中，式(I)中的D1为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割式(I)的化合物的化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文提供的方面的一些实施方案中，用于切割式(I)的化合物的化学试剂为三(2-羧乙基)膦。本专利技术的另一个方面提供了一种组合物。该组合物包含四种作为可逆终止子的核苷5’-三磷酸，其中所述核苷5’-三磷酸的每个3’位置用可切割化学基团加帽，该可切割化学基团经由醚键与3’碳连接。所述四种核苷5’-三磷酸中的每一种具有不同的碱基，其中每个不同的碱基具有通过可切割连接体与其附接的不同的可检测标记物。此外，所述可切割连接体包含二硫键。所述二硫键和在3’位置的可切割化学基团可被化学试剂切割。由于每个不同的可逆终止子可包含不同的可检测标记物，从而实现了每种不同类型的可逆终止子的检测和区分。另外，在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述不同的碱基连接的游离巯基基团。在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，每个不同的可检测标记物为荧光团。在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，所述化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。在本文针对所述组合物提供的方面的一些实施方案中，所述化学试剂为三(2-羧乙基)膦。本专利技术的另一个方面提供了用于对多核苷酸进行测序的方法，该方法包括：在包含待测序的靶多核苷酸、与待测序的靶多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸引物、催化量的聚合酶以及一种或多种本专利技术公开的核苷5’-三磷酸类似物的反应体系中进行聚合反应。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于400μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于100μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于50μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于10μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于5μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于3μM。在本文针对所述测序方法提供的方面的一些实施方案中，所述一种或多种5’-三磷酸类似物的浓度不大于2μM。本专利技术的再一个方面提供了对多核苷酸进行测序的方法。该测序方法包括：在包含待测序的靶多核苷酸、与待测序的靶多核苷酸杂交的一种或多种多核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷5’‑三磷酸类似物，其具有1)糖部分，该糖部分包含对该糖的3’‑OH基团加帽的可切割化学基团，2)通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基，其中：所述可切割连接体包含二硫键；所述二硫键和所述可切割化学基团均能被化学试剂切割；并且在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述碱基连接的游离巯基基团。

【技术特征摘要】
2015.05.08 US 62/159,0171.一种核苷5’-三磷酸类似物，其具有1)糖部分，该糖部分包含对该糖的3’-OH基团加帽的可切割化学基团，2)通过可切割连接体与可检测标记物附接的碱基，其中：所述可切割连接体包含二硫键；所述二硫键和所述可切割化学基团均能被化学试剂切割；并且在所述二硫键被所述化学试剂切割后，不存在与所述碱基连接的游离巯基基团。2.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述碱基为嘌呤或嘧啶。3.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述可检测标记物为荧光团。4.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述碱基选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。5.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。6.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述糖部分为2-脱氧核糖。7.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述化学试剂为三烷基膦或三芳基膦。8.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述化学试剂为三(2-羧乙基)膦。9.根据权利要求1所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中所述核苷5’-三磷酸类似物为式(I)或其盐和/或质子化形式：其中：X为O、S或BH3；w为1、2、3、4或5；B为任选取代的杂环核酸碱基或其类似物；L1为第一连接基团，且L1的长度为3-25个原子；L2为第二连接基团，且L2的长度为3-4个原子；L3为第三连接基团，且L3的长度为4-47个原子；且D1为所述可检测标记物。10.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中：L1为n为0或1；R1为R2为p为0-3，q为0-12，r为1-3；并且Z为O或NH。11.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中：L2为并且m为2或3。12.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中：L3为Q独立地选自不存在、和并且R3和R4独立地为p为0-3，q为0-12，r为1-3。13.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中：w为1；X为O；L1为L2为L3为R4为p为0-3，q为0-12，r为1-3；并且Q选自不存在、和14.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中B选自且Y为CH或N。15.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中B为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的类似物。16.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类似物，其中D1为荧光团。17.根据权利要求9所述的核苷5’-三磷酸类...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫迪·简恩，肯德尔·霍夫，格伦·麦克加尔，伟·周，
申请(专利权)人：桑特里莱恩科技控股公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛;KY