一种快速鉴定白桑种的方法技术

本发明专利技术公布了一种快速鉴定白桑种的方法，步骤如下：（1）针对桑种特异位点设计并合成一对引物；（2）从桑树的新鲜叶片中提取总DNA；（3）PCR扩增；（4）PCR酶切；（5）电泳鉴定。本发明专利技术所述方法不依赖于桑树传统形态分类经验，具备一定分子生物学经验的操作者均可独立、准确、快速的完成，得出准确的判断；且本发明专利技术检测过程绿色安全，所用仪器均为普通常规设备，费时少，可在5小时内完成鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物品种鉴定方法，具体涉及一种快速鉴定白桑种的方法。
技术介绍
中国是桑树的重要起源中心，拥有丰富的桑树种质资源。桑树的分类一直以来都得到世人的关注，过去人们专注于桑属形态分类，并建立了不同的桑属分类系统。然而，传统的桑属分类系统鉴定数目差异极大。其中，起源于中国的白桑（White mulberry，Morus alba L.）通过“古老丝绸文明”的传播广泛分布于世界各地，由于各地栽培环境差异较大，形成了具有显著差异的表型特征。白桑的这种系统变异导致其亚种或变种数量众多，是桑属植物传统系统分类复杂而多变的重要因素之一。因此，厘清白桑种不但是完成桑属分类最重要的一环，而且对于种间杂交育种亲本选择、品种资源开发和利用等研究都具有重要的意义。随着桑树基因组的完成，家蚕基因组生物学国家重点实验室桑树研究单元于近期提出桑属可分为8个种，将过去形态分类上属于不同桑种的华桑（M. cathayana）、长穗桑（M. wittiorum）、奶桑（M. macroura）、蒙桑（M. mongolica）和鸡桑（M. australis）等归于白桑种。然而，当前现有桑树形态分类系统，仍然将上述桑树资源列为不同的种。针对上述问题，研究并开发设计一种快速鉴定白桑种的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：现有鉴定白桑种是根据桑树传统形态进行分类，该方法鉴定准确率低，周期长，需要较强的专业背景，易受人为因素影响。现提供一种快速鉴定白桑种的方法，根据白桑树转录间隔区序列ITS的BstEII酶切位点的不同，采用BstEII酶切可快速将白桑种与其他桑种区别，简单快捷的鉴定形态差异显著的白桑种。解决了现有白桑种鉴定分类差异大，方法复杂，重复性不好、依赖经验的技术问题。本专利技术的通过下述技术方案实现：步骤如下：（1）针对桑种特异位点设计并合成一对引物；上游引物为GTAACAAGGTTTCCGTAGGTG，下游引物为TAAACTCAGCGGGTAGCC；（2）提取DNA；（3）PCR扩增；（4）PCR产物酶切；（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定。进一步地，所述步骤（4）PCR酶切具体操作方法为：所述步骤（4）PCR酶切具体操作方法为：将PCR扩增产物的一半作为酶切反应的底物于PCR管中，加入2.0uL10X BstEII酶切缓冲液，0.2uL100X BSA，1.0uL BstEII，6.8uL重蒸馏水，混匀，60℃酶切2h。进一步地，所述PCR酶切反应使用的限制性内切酶BstEII，识别点为识别点为“GGTNACC”的所有内切酶。进一步地，所述识别点“GGTNACC”包括“GGTGACC”和“GGTTACC”。进一步地，所述步骤（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定白桑种方法为：分别取10uL步骤（3）PCR扩增产物、20uL步骤（4）PCR酶切产物，均采用2%琼脂糖电泳检测产物条带。进一步地，所述步骤（2）提取DNA的方法包括以下步骤：（2.1）取0.8—1.2cm2的桑幼嫩叶片，置于1.5mL离心管中，加入150uL基因组提取液，用研磨棒研磨至基因组提取液呈现绿色或没有明显团块，即得溶液A；（2.2）向溶液A中加入150ul异丙醇，混匀，离心，弃上清，即得离心管底部沉淀B；（2.3）沉淀B用75%乙醇清洗，离心，弃上清，即得离心管沉淀C；（2.4）沉淀C经干燥处理后，加入50uL重蒸馏水溶解沉淀后获得的溶液为提取的基因组DNA模板。其中，DNA提取液由0.2M Tris-HCl (pH=8.0)，0.25M NaCl，0.025 M EDTA，0.5% SDS组成。进一步地，所述步骤（2.2）中离心操作方法为：13200rpm常温离心10min。进一步地，所述步骤（2.3）中离心操作方法为：13200rpm常温离心3min。进一步地，所述步骤（3）PCR扩增具体步骤为：所述步骤（3）PCR扩增具体步骤为：PCR反应体系为20uM上游引物和下游引物各0.1uL，10 X PCR buffer2.0uL，10 mM dNTPs2.0uL，1.5uL步骤（2）提取的基因组模板，用双蒸馏水补充体积至20uL；PCR反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30s，57-61℃退火30s，72℃延伸40s，共32-45个循环；72℃终延伸5 min。与现有技术相比，本专利技术基于白桑种特异性酶切位点“GGTGACC”和“GGTTACC”，建立一种快速鉴定白桑种的方法，该鉴定方法在桑树总DNA提取、PCR扩增、PCR酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定上与传统的方法完全不同。传统鉴定白桑种的方法为：对桑属形态分类，建立不同的桑属分类系统，该鉴定方法结果桑种数目差距较大。由于起源于中国的白桑通过丝绸文明传播广泛分布于世界各地，且各地的栽培环境差异较大，形成的表征特征差异显著。白桑种系统变异大导致其亚种或变种数量众多，采用传统的鉴定方法必须依赖于白桑种传统形态分类经验才可进行鉴定。采用本专利技术所述方法，对仪器设备要求简单，检测过程绿色安全，费时少。桑树内转录间隔区序列（Internal Transcribed Spacer, ITS）包括ITS1、5.8S和ITS2、桑属种间ITS长度从611bp-631bp，经研究，白桑种内转录间隔区序列ITS，其具有两个BstEII酶切位点“GGTGACC”，“GGTTACC”，而其他桑种只具有一个或没有BstEII酶切位点。且上游BstEII酶切位点靠近ITS1上游边界50bp，故将设计的上游引物为GTAACAAGGTTTCCGTAGGTG，下游引物TAAACTCAGCGGGTAGCC，分别设计在18S的03端和28s的5端，分别引入 41bp和33bp的序列扩增酶切产物的长度便于酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测。通过BstEII酶切电泳检测可快速、准确、方便区别白桑种与其他桑种。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：（1）高敏感性：本专利技术建立的PCR-酶切方法，极大的提高了检测的敏感性。（2）简便快速：本专利技术所采用的设备均为常规设备，且结果易于分析，费时少，可在5小时内完成鉴定，不需要克隆测序对比分析等环节。（3）准确率高：本专利技术不依赖于桑树传统形态分类经验，只要具备一定分子生物学经验的操作者均可独立、快速、准确的完成，并得出准确的判断。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为本专利技术实施例1中桑属ITS部分序列及其BstEII酶切位点；图2为本专利技术实施例1中桑树种资源ITS序列PCR扩增及BstEII酶切电泳图；图3为未知桑树样品PCR扩增及BstEII酶切电泳图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。本技术方案中涉及到10 mM dNTPs表示10mmol/l dNTPs，10X BstEII酶切缓冲液、100X BSA中的X表示应稀释的倍数，上述为本领域的公知常识。实施例1：一种快速鉴定白桑种的方法，包括步骤如下：1、本专利技术所需主要试剂：试验所用的引物来源，10X PCR buf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于，步骤如下：（1）针对桑种特异位点设计并合成一对引物；上游引物为GTAACAAGGTTTCCGTAGGTG，下游引物为TAAACTCAGCGGGTAGCC；（2）提取DNA；（3）PCR扩增；（4）PCR产物酶切；（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于，步骤如下：（1）针对桑种特异位点设计并合成一对引物；上游引物为GTAACAAGGTTTCCGTAGGTG，下游引物为TAAACTCAGCGGGTAGCC；（2）提取DNA；（3）PCR扩增；（4）PCR产物酶切；（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于，所述步骤（4）PCR酶切具体操作方法为：将PCR扩增产物的一半作为酶切反应的底物于PCR管中，加入2.0uL10X BstEII酶切缓冲液，0.2uL100XBSA，1.0uL BstEII，6.8uL重蒸馏水，混匀，60℃酶切2h。3.根据权利要求1或2所述的一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于：所述PCR酶切反应使用的限制性内切酶BstEII，识别点为“GGTNACC”的所有内切酶。4.根据权利要求3所述的一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于：所述识别点“GGTNACC”包括“GGTGACC”和“GGTTACC”。5.根据权利要求4所述的一种快速鉴定白桑种的方法，其特征在于：所述步骤（5）琼脂糖凝胶电泳鉴定白桑种方法为：分别取10uL步骤（3）PCR扩增产物、20uL步骤（4）PCR酶切产物，均采用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物条带。6.根据权利要求4所述的一种快速鉴定白桑种的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾其伟，何宁佳，陈继林，戴新华，张超，马赑，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50