制备人造微环境的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及制备人造微环境的方法及其应用，具体地，所述方法包括：(1)将功能细胞接种在固相载体上；(2)将步骤(1)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及(3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。利用本发明专利技术所提供的方法，可以制备获得具备低免疫原性，良好的可控性，质量稳定，生产周期短和成分可调控特点并可实现定制化的人造微环境。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学工程领域，具体地，本专利技术涉及制备人造微环境的方法及其应用。
技术介绍
再生医学的发展为应对药物治疗难于见效的复杂重大疾病带来了新的希望，逐渐成为临床医学发展的重要方向，有望成为继药物和器械治疗之后下一个医疗健康行业的支柱产业。目前，再生医学已在临床成功地用于皮肤再生，关节软骨重建，肌腱、脊髓损伤修复，免疫系统功能重建等，并在治疗疑难病症(如遗传性疾病和心血管类疾病)和各类器官组织(如神经、肝脏、心脏、胰腺等)修复和再生的动物模型和临床试验中显示出良好效果。再生医学领域中，构建人体复杂器官的结构与功能替代物、解决人体器官移植的来源问题、或以组织工程手段修复受损组织器官是人们最早也是最终的梦想。在器官的修复与移植来源供不应求的今天，人工器官替代物有着临床应用的巨大需求，而已经批准进行临床治疗的人工替代物的种类还十分有限，主要集中在皮肤、角膜、软骨等结构与功能还较为简单的器官上，其构建的基本思路可大致分为两种：人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料。然而，目前人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料仍有待改进。
技术实现思路
专利技术人发现人工合成替代材料与天然组织的脱细胞化基质材料存在以下缺陷：1、人工合成替代材料。生物材料一直是组织工程与再生医学中的核心因素，利用一些人工高分子材料或天然高分子材料作为原料来构建人工替代物，以用于临时替代受损器官的功能并帮助其修复，这是目前常见的人工手段。例如皮肤的人工替代物常制成双层结构模拟真实皮肤的表皮与真皮的结构与功能。但单独的材料用于治疗时，由于其结构与成分与天然皮肤有较大区别，其治疗效果受到明显的局限。参考细胞的加入对于许多疾病治疗而言有着明显的促进作用，将细胞与材料结合并用于治疗则会表现出明显改善的治疗效用，但这也带来了许多不便利：细胞的加入带来的可能问题有自体细胞难以扩增和培养，或是异体细胞引起免疫反应。此外，细胞产品的保存运输问题、产品质量问题、可能存在不良副作用的问题等都制约了其在临床治疗上的应用。2、天然组织脱细胞化基质材料。鉴于细胞产品在临床治疗上难以实际运用，而相对的，人们日益发现细胞微环境在治疗过程中起到重要作用。利用细胞的微环境来进行治疗而不是引入活性细胞成为了一种新的思路。通过脱细胞化技术将组织中的细胞成分尤其是细胞膜与附着的抗原蛋白除去从而避免了细胞可能带来的免疫排斥反应；同时，脱细胞化保留了组织中的细胞外基质、细胞因子等成分，更好的模拟了细胞生长的正常微环境从而同样可以发挥治疗效果。所以，相较于带细胞的治疗产品而言，脱细胞化治疗产品由于没有细胞成分且从正常组织中得到使其具有保存与运输更为方便的特点。但相较于人工合成材料而言，虽然脱细胞化材料具有更接近体内微环境的成分与结构带来了更好的疗效，但是直接通过组织脱细胞化获得的基质材料其来源受到限制，例如脱细胞化的皮肤修复产品往往是通过对尸体的皮肤或是异种例如猪的皮肤处理后得到，且异体来源组织存在病人等待周期长，伦理问题等，异种来源组织最大的问题则是存在免疫周期。此外其质量难以稳定、材料的物理特性难以保持使其仍具有一定的使用限制。总体而言，目前针对器官替代修复的产品都基本采取以上的两种治疗策略，能够解决一部分临床对组织替代物的需求，但是仍然存在一系列的问题，特别是对于使用便携性和治疗效果的稳定性的追求仍在继续。而人工合成替代材料与天然组织脱细胞化基质材料之间则有着矛盾与平衡取舍的关系，来源与稳定性是人工合成替代材料的优势，而天然组织脱细胞化基质材料则有着更好的治疗效果。如何平衡这两个问题，或者结合两者的优点是将人工组织修复水平进一步提高的关键。本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本专利技术是专利技术人基于以下发现所获得的：基于多孔生物材料和组织工程为基础，辅助以脱细胞化技术，构建了基于仿生人造组织的脱细胞化人工微环境。这种新型的仿生微环境基于生物材料骨架从而具有稳定的内部结构，在使用过程中具有良好的机械性能及良好的可塑性，使其应用便捷且可根据实际需求调整尺寸等。在力学性质日益受到重视时，稳定的物理性对治疗效果的影响变得越发重要。其次，辅以细胞培养与脱细胞化操作，使其在普通生物材料基础上集成了大量细胞分泌的细胞外基质成分与细胞因子等，从而构建了一个更接近体内天然内环境的人工微环境，能够提高治疗效果。由此，本专利技术提供了一种具备低免疫原性，良好的可控性，质量稳定，生产周期短和成分可调控特点并可实现定制化的新型脱细胞化人造微环境(仿生微环境治疗物)，为创伤修复，组织器官修复等再生医学治疗提供一种新思路。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种制备人造微环境的方法，包括：(1)将功能细胞接种在固相载体上；(2)将步骤(1)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；
以及(3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。本专利技术所提供的方法具有以下优势：(1)采用所述方法制备获得的人造微环境使用时无细胞，具有低免疫原性的特点；(2)使用独特的组织工程细胞培养技术及脱细胞化处理技术，可以很好的解决目前现有主流产品面临的免疫原性、生命伦理、生物相容性等问题，同时保留细胞外基质生物活性成分，实现创伤的有效修复；(3)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化仿生微环境)方便长期贮存和运输；(4)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化仿生微环境)具有良好的可控性，避免了因来源不同所导致的质量不稳定，批次间差异性较大等问题；(5)采用所述方法制备获得的人造微环境(脱细胞化微环境)可根据患者需求进行定制化处理，产品生产周期可控，满足临床需求。根据本专利技术的一些实施例，所述功能细胞包括选自动物干细胞、体细胞和癌细胞的至少之一。根据本专利技术的一些实施例，所述动物为哺乳动物，优选为人；根据本专利技术的具体实施例，所述干细胞选自下列至少之一：胚胎干细胞，多潜能干细胞，脂肪干细胞、骨髓干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞、角膜干细胞、皮肤干细胞、上皮干细胞；根据本专利技术的具体实施例，所述体细胞选自下列至少之一：成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞；根据本专利技术的具体实施例，所述癌细胞为原代癌细胞和/或癌细胞系。根据本专利技术的一些实施例，所述方法进一步包括：对所述功能细胞进行-处理，其中还，所述处理包括基因修饰和/或生物化学因子诱导方式。由此可以对所述功能细胞进行体外改造，从而满足不同的实际应用的需要。由此，可以通过细胞基因修饰和/或生物化学因子诱导方式来修饰细胞和改变细胞脱细胞化微环境的有效成分以达到多样化、定制化的要求。根据本专利技术的一些实施例，所述方法进一步包括：对所述功能细胞进行调控式培养，其中，可以通过调控培养的培养时间、培养基、添加物和氧气含量中的至少一种，从而来调控所述功能细胞的多样性。由此，可以通过细胞培养条件来修饰细胞和改变细胞脱细胞化微环境的有效成分以达到多样化、定制化的要求。根据本专利技术的一些实施例，所述接种是将单细胞悬浮液滴加至所述固相载体上而进行的，其中，所述单细胞悬浮液含有所述功能细胞。根据本专利技术的一些实施例，所述单细胞悬浮液是通过将所述功能细胞进行胰酶处理而得到的。根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备人造微环境的方法，其特征在于，包括：(1)将功能细胞接种在固相载体上；(2)将步骤(1)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及(3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。

【技术特征摘要】
1.一种制备人造微环境的方法，其特征在于，包括：(1)将功能细胞接种在固相载体上；(2)将步骤(1)所获得的固相载体在适于所述功能细胞生长的条件下保持预定时间；以及(3)将步骤(2)所获得的固相载体进行脱细胞化处理，以便获得所述人造微环境。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述功能细胞包括选自动物干细胞、体细胞和癌细胞的至少之一；任选地，所述动物为哺乳动物，优选为人；任选地，所述干细胞选自下列至少之一：胚胎干细胞，多潜能干细胞，脂肪干细胞、骨髓干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞、角膜干细胞、皮肤干细胞、上皮干细胞；任选地，所述体细胞选自下列至少之一：成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞；任选地，所述癌细胞为原代癌细胞和/或癌细胞系。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述接种是将单细胞悬浮液滴加至所述固相载体上而进行的，其中，所述单细胞悬浮液含有所述功能细胞。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述单细胞悬浮液是通过将所述功能细胞进行胰酶处理而得到的。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述单细胞悬浮液的浓度为1x105/mL-1x107/mL，任选地，所述单细胞悬浮液的浓度为1x106/mL。6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：(1-1)将单细胞悬浮液滴加到所述固相载体上；(1-2)将步骤(1-1)所获得的固相载体在二氧化碳培养箱中静置2小时。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相载体由可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成，任选地，所述可交联的人工合成生物材料选自下列至少之一：聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜亚楠，李雅倩，蒋书萌，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11