一种拟南芥SOD1蛋白及其在化妆品中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种拟南芥SOD1蛋白及其在化妆品中的应用，属于基因工程技术领域。一种拟南芥SOD1蛋白，由拟南芥At1g08830基因编码，通过在大肠杆菌中异源表达、分离和纯化获得。所述的拟南芥SOD1蛋白在化妆品中的应用，将所述SOD1蛋白添加进化妆品中，获得抗氧化化妆品。本发明专利技术明通过异源表达所获得的植物拟南芥SOD1蛋白可以提高模拟化妆品的抗氧化特性，进一步说明通过基因工程手段可以对植物的天然抗氧化蛋白酶进行操作来获得更多的天然抗氧化蛋白，而获得的这些蛋白可以应用到化妆品的研制中，为利用植物抗氧化基因生产天然抗氧化化妆品提供了一种新的工具和思路，具有重要的指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种拟南芥SOD1蛋白在化妆品中的应用。
技术介绍
近年来，国内外抗衰老化妆品的市场销售量逐年增加，市场热度连年不减。随着这种市场的迅速发展，人们对化妆品的安全性成分要求也越来越高，主要表现在：更加注重天然的植物提取成分。抗衰老抗氧化成分的安全性、可靠性、无刺激性、无任何致敏物质和无不良反应等成为此类化妆品的主要卖点。现在流行的酶抗氧化来预防皮肤的衰老，能够有效阻止氧自由基对皮肤老化的加速和损伤过程。随着科技的进步及研究的深入，今后也将会有更多的技术应用及无害成分的添加，使得整个化妆品行业更加安全，效果更加显著。拟南芥At1g08830基因编码一种超氧化物歧化酶（SOD），目前的研究结果表明，从微生物，动物到植物，从单细胞生物到人类，SOD都广泛存在。SOD现已被认为是一种新型酶制剂，同时也是生物体内重要的抗氧化酶。众所周知，不管是植物应对逆境，还是动物乃至人类的疾病产生都与细胞内的活性氧（ROS）密切相关。ROS在细胞内的不断积累会加剧细胞的病变和衰老。SOD是细胞内产生的清除ROS的一种重要蛋白酶，被视为生命科技中最具神奇魔力的酶，是氧自由基的自然天敌，是清除机体内氧自由基的首要功能酶。该基因的CDS长度为469个碱基，编码152个氨基酸的蛋白，已有研究表明拟南芥At1g08830基因在植物应答逆境胁迫，如干旱、高温、盐害等时都会表现出明显的上调表达现象，也说明该基因可以提高植物的抗逆性，这种抗逆性的发挥与其具有较强的ROS清除能力息息相关。目前的抗氧化化妆品多是基于对植物成分的提取和添加，并没有天然纯化蛋白的参与，而由此产生的高技术附加值，高效抗氧化性能的化妆品还没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种拟南芥At1g08830基因编码的蛋白（命名为SOD1蛋白），作为一种天然抗氧化蛋白，能够清除细胞内产生的活性氧。本专利技术的另一个目的是提供一种拟南芥At1g08830基因编码的SOD1蛋白在化妆品中的应用，以提高化妆品的抗氧化性能。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种拟南芥SOD1蛋白，通过下述方法获得：步骤S1：克隆拟南芥At1g08830基因，进行载体构建，获得具有HIS标签的融合基因重组载体；步骤S2：通过遗传转化和重组载体的筛选获得具有At1g08830基因的阳性菌株，同时提取重组质粒并转化受体蛋白表达菌株，通过筛选和鉴定获得具有At1g08830基因的阳性表达菌株；步骤S3：利用异丙基硫代半乳糖苷诱导所述阳性表达菌株进行表达，离心，过HIS柱，获得纯化的SOD1蛋白。进一步的，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达菌株进行表达的条件为：温度16~37℃，时间3~20h，转速210~230rpm，异丙基硫代半乳糖苷的浓度为0.01mmol/l~0.1mmol/l。进一步的，所述利用异丙基硫代半乳糖苷诱导阳性表达菌株进行表达的条件为：温度28℃，时间5~6h，转速220rpm，异丙基硫代半乳糖苷的浓度为0.01mmol/l。本专利技术还提供了上述拟南芥SOD1蛋白在化妆品中的应用，将所述SOD1蛋白添加进化妆品中，获得具有抗氧化功效的化妆品。本专利技术与现有技术相比，其有益效果如下：本专利技术属于基因工程领域，具体是通过构建拟南芥At1g08830基因编码的HIS标签的融合蛋白载体，通过在大肠杆菌中进行At1g08830基因的异源表达获得天然SOD1蛋白，然后通过体外抗氧化实验分析摸索拟南芥SOD1蛋白在化妆品方面的应用。本专利技术清楚地表明通过异源表达所获得的植物拟南芥SOD1蛋白可以提高模拟化妆品的抗氧化特性，进一步说明通过基因工程手段可以对植物的天然抗氧化蛋白酶进行操作来获得更多的天然抗氧化蛋白，而获得的这些蛋白可以应用到化妆品的研制中。本专利技术人将获得的天然SOD1蛋白与甘油进行不同比例浓度的配比，进行抗氧化特性分析，确定该天然SOD1蛋白具有抗氧化能力。本专利技术方法的建立为进一步探索SOD1蛋白的抗氧化能力，利用植物抗氧化基因生产天然抗氧化化妆品提供了一种新的工具和思路，具有重要的指导意义。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明。图1：PET-28a（+）载体的质粒谱图；图2：PCR扩增获得的At1g08830克隆基因的电泳图，其中，M表示分子量Marker，1表示从拟南芥基因组中克隆At1g08830基因的PCR产物，箭头所指为At1g08830基因；图3：对质粒和At1g08830克隆基因进行双酶切的电泳图，其中，M表示分子量Marker，1~3依次表示At1g08830克隆基因的质粒PCR 的DNA，质粒对照的DNA，质粒双酶切的DNA；图4：菌落PCR筛选的阳性菌株的电泳图，其中，箭头所指为At1g08830克隆基因的菌落PCR扩增片段；图5：SOD1蛋白小量诱导蛋白的SDS-PAGE电泳图，IPTG浓度为0.01mmol/l；1~6依次表示SOD1蛋白的16℃上清液和全蛋白、28℃上清液和全蛋白、未诱导上清液和全蛋白；图中标记蛋白部分为诱导出的蛋白；图6：大量诱导后纯化获得的SOD1蛋白电泳图，箭头所指为纯化获得的SOD1蛋白；图7：测定纯化SOD1蛋白浓度的标准曲线。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步清楚阐述本专利技术的内容，但本专利技术的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。拟南芥At1g08830基因的CDS长度为469个碱基，编码152个氨基酸的蛋白，该基因所编码的蛋白质是植物重要的抗氧化酶，能够清除体内产生的ROS，从而提高植物的抗逆性。本专利技术拟南芥At1g08830基因编码的蛋白命名为SOD1蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，由152个氨基酸组成。本专利技术中所使用的甘油，化学名称为丙三醇，是一种无色透明粘稠液体，无臭，味甜，具有良好的吸湿保湿作用，普遍应用于各种化妆品中，给皮肤角质层补充水分，调节肌肤生理作用，保持肌肤健康，并提高使用感。为了探索本专利技术所获SOD1蛋白的抗氧化性能，本专利技术将其与甘油配合，模拟化妆品，制备成样品，从而测定和分析上述样品的抗氧化性能。实验一、通过基因工程操作构建具有HIS标签的SOD1融合基因重组载体参阅图1，本专利技术所采用的克隆载体为PET-28a(+)。为了获得SOD1的克隆基因，首先是提取RNA，具体步骤为：取0.1g新鲜拟南芥叶片组织于研钵，加一定的液氮快速研磨成粉末；转入提前已添加1mlTrizol的离心管中；室温放置5min，加入0.2ml氯仿，用力摇晃15s，放置5~10min；置于低温离心机中，4℃，12000rpm，15min后取上清；加入0.5ml的异丙醇，室温放置10min；再次置于低温离心机中，4℃，12000rpm，10min，弃上清；加1ml75%乙醇洗管底的乳白色沉淀；置于低温离心机，4℃，7500rpm，5min，弃上清；晾干沉淀，溶于适当体积的无RNase的高温灭菌双蒸水中，置于-20℃保存备用。然后，通过反转录PCR获得cDNA，再通过At1g08830基因特异的引物进行At1g08830基因的克隆。引物序列为：SOD1-F：5'GGAATTCATGGCGAAAGGAGTTG3'(EcoR1)SOD1-R：5'CCCAAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟南芥SOD1蛋白，其特征在于，通过下述方法获得：步骤S1：克隆拟南芥At1g08830基因，进行载体构建，获得具有HIS标签的融合基因重组载体；步骤S2：通过遗传转化和重组载体的筛选获得具有At1g08830基因的阳性菌株，同时提取重组质粒并转化受体蛋白表达菌株，通过筛选和鉴定获得具有At1g08830基因的阳性表达菌株；步骤S3：利用异丙基硫代半乳糖苷诱导所述阳性表达菌株进行表达，离心，过HIS柱，获得纯化的SOD1蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥SOD1蛋白，其特征在于，通过下述方法获得：步骤S1：克隆拟南芥At1g08830基因，进行载体构建，获得具有HIS标签的融合基因重组载体；步骤S2：通过遗传转化和重组载体的筛选获得具有At1g08830基因的阳性菌株，同时提取重组质粒并转化受体蛋白表达菌株，通过筛选和鉴定获得具有At1g08830基因的阳性表达菌株；步骤S3：利用异丙基硫代半乳糖苷诱导所述阳性表达菌株进行表达，离心，过HIS柱，获得纯化的SOD1蛋白。2.如权利要求1所述的拟南芥SOD1蛋白，所述利用异丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉伟，杨伟林，法明，陈斯楠，侯楠，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41