减毒活疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种制备适合作为疫苗候选物的活减毒细菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：A.提供能够表达谷氨酸消旋酶和可能的D‑氨基酸转氨酶且包含肽聚糖细胞壁的细菌菌株，以及B.以细菌菌株不再能够表达功能性谷氨酸消旋酶和/或功能性D‑氨基酸转氨酶的方式失活编码谷氨酸消旋酶的基因或多个基因，以及如果需要，失活编码酶D‑氨基酸转氨酶的基因或多个基因；其中所述基因的失活导致所述细菌菌株成为D‑谷氨酸营养缺陷型的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供活减毒细菌疫苗。本专利技术还提供可以获得这类疫苗的方法。
技术介绍
包括人在内的温血动物克服微生物发病机制的方式是一个复杂的过程。对微生物发病机制的免疫是温血动物避免发病机制或遭受不那么激烈的致病状态的一种方式。对给定病原体的不完全免疫导致暴露于病原体的群体中的发病和死亡。一般认为基于活的但是减毒的微生物的疫苗(减毒活疫苗)诱导高效类型的免疫应答。这类疫苗具有优势，一旦动物宿主已免疫接种，微生物病原体进入宿主会诱导加速召回较早的、细胞介导的或体液免疫，其能够在感染可以呈现临床上显著比例之前控制生物体的进一步生长。一般承认基于杀死的病原体的疫苗(灭活疫苗)不能获得这种类型的应答。但是，根据减毒水平，包含活病原体的疫苗存在危险，在免疫接种时，免疫接种的宿主可能感染寻求保护的疾病。因此，具有活微生物的免疫属性但是在免疫接种时不能引起不良副作用的疫苗是可取的。但是，重要的是注意减毒细菌菌株作为疫苗候选物的有效使用不可以仅通过这样的减毒水平来预测。在这方面，减弱细菌的一般方法是去除一个或多个毒力因子(遗传修饰生物体–GMO)，但是，在大多数情况下，毒力因子作为保护性表位还在诱导免疫中发挥作用。在那些情况下，毒力因子的缺失不可避免地削弱细菌的免疫原性能力。这当然是不希望的情况。因此，活疫苗应当优选保留野生型菌株的抗原补体。此外，一旦建立减毒水平，对特定类型的疫苗候选物的免疫应答以及包含这类微生物的疫苗组合物的成功仍然受到如下文详述的许多因素的影响：a.减毒活疫苗菌株应当优选基本上不可能回复其原始状态(通常为毒性野生型菌株)，并且其他基因不应当补充所操作的基因，导致细菌能够引起疾病(优选稳定突变)。b.如果不考虑，活疫苗中内毒素的存在可以是缺点，因为这些分子可以引起严重的全身反应。而且，全细胞疫苗的给药是局部反应原性(严重疼痛、局部肿胀和水肿、脂膜炎或溃疡等)的经典风险因素。c.减毒GMO的活力和适应度不应当受到剧烈影响，因为期望在体内发生一些复制以产生足够的微生物及其抗原以刺激免疫系统。事实上，基因中的任何突变均可能干扰复制或可能损伤瓶中的活微生物，引起疫苗失效。因此，必须仔细评价每种类型的遗传修饰对细胞的意外效应。d.此外，当选择基因靶标用于基因操作时，应当考虑基因共享或蛋白兼职–由此蛋白可以执行一个以上功能的现象。许多蛋白兼职酶。一个实例为谷氨酸消旋酶(MurI)，其是细胞壁生物合成中的关键酶，但是还在促旋酶抑制中起作用。由于其多功能特征，不可以预测靶向MurI策略的可用性，除非获得这些基因中的突变并评价对细菌细胞生理的影响。e.此外，疫苗引发的免疫应答的类型可能不适合提供对感染的足够保护(疫苗失败)。对有效疫苗的具体要求会根据病原体的性质而变化。在细胞外病原体的情况下，主要抗体为生物体的防御提供适应机制，而T细胞的存在在控制细胞内生物体中必不可少。结果，减毒活疫苗用作较好的免疫原，其通过简单操作杀死细菌或亚基组成，以及修饰体内感染期间出现的细菌抗原。因此，减毒活菌株可以引起更广泛和充分的免疫应答，特别是在细胞内阶段。在这个意义上，减毒的靶向基因策略应当在疫苗候选物中仔细测试，因为所操作的细菌利用感染的天然途径的能力可能受损且不触发广泛保护的免疫应答。f.此外，无关减毒水平或引发的免疫应答类型，用特定GMO给药以达到可接受的保护水平的剂量数量(有效和持久)对于疫苗时间表可以是无法持续的。g.此外，疫苗的给药途径可以决定增加的免疫应答类型，并且对于其成功至关重要。根据给药途径，疫苗可以以不同方式进入生物体：皮肤(在这种情况下，抗原由在区域淋巴结的T-区中充当抗原呈递细胞的朗格汉斯细胞吸收)；粘膜(这里抗原的捕获主要由M细胞进行，并且免疫应答在淋巴集结中发展)或血液(抗原会靶向脾，在这里其会通过脾巨噬细胞加工)。结果，一旦对GMO建立减毒水平，疫苗给药的部位可以决定免疫接种的失败或成功。在这方面，已证实乳房内而不是腹腔内给药减毒活金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株显著减少用野生型菌株攻击之后乳腺中的细菌负荷。提议的疫苗候选物金黄色葡萄球菌8325-4 A523是用亚硝基胍诱变之后分离的温度敏感突变体，其在低温(低于32℃)下复制良好，但是当转移至哺乳动物体温时经历有限数量的分裂。作者用金黄色葡萄球菌8325-4野生型菌株进行攻击实验以比较免疫接种和未免疫接种的动物之间乳腺中的细菌负荷作为疫苗保护效力的度量。这些作者得出以下结论：“从通过乳房内途径免疫的小鼠乳腺恢复的金黄色葡萄球菌CFU数量显著低于(7x102CFU)在对照小鼠中发现的金黄色葡萄球菌CFU数量(1.5x105CFU)。相反地，从通过任何腹腔内方案免疫的小鼠乳腺恢复的CFU数量与从对照小鼠腺恢复的CFU数量一样高(P>0.5)”。因此，即使用潜在的候选物，给药途径仍可以决定减毒活突变体作为疫苗的效力。h.最后，疫苗可以不能诱导针对相同细菌物种的多个菌株的交叉反应抗体。虽然减毒活菌株可以引发在动物模型中保护的抗体，但是一般仅在用来产生疫苗菌株的亲本菌株也用于攻击研究时看到这种保护。针对其他菌株的基础广泛的保护通常未可靠产生或测试。此外，虽然充分引发和交叉反应，但是所产生的抗体在用野生型病原体攻击的模型中可能不会持续很久且没有保护性。总的来说，活疫苗应当足够减毒(或无毒)以避免不可接受的病理效应，但是在另一方面，其必须引发足够的免疫应答，所述免疫应答能够在宿主中赋予独立于细菌菌株的针对疾病的持久保护(保护性免疫)。证实活疫苗是足够减毒(或无毒)以避免不可接受的病理效应且引发能够在宿主中赋予独立于细菌菌株的针对疾病的持久保护(保护性免疫)的足够免疫应答并不是容易的任务。在这个意义上，WO99/25376描述了一种在哺乳动物中引发针对抗原的T细胞免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药表达所述抗原的李斯特菌(Listeria)的营养缺陷型减毒菌株。其中所述营养缺陷型减毒菌株描述为在至少一个基因中具有突变，所述基因的蛋白产物对于李斯特菌的生长必不可少。特别地，本专利技术描述了D-丙氨酸合成的营养缺陷型减毒菌株，其进一步包含编码异源抗原的DNA，其中所述异源抗原优选为HIV-1抗原。在WO99/25376中，结果表示为显示李斯特菌的营养缺陷型菌株在BALB/c小鼠中提供针对单增李斯特菌(L.monocytogenes)攻击的保护，使得这种菌株据说适合用于疫苗组合物，用于针对这种生物体引起的感染的保护。但是，其中提供的实验实例仅仅建立单增李斯特菌的减毒营养缺陷型D-丙氨酸突变体引发CTL(宿主细胞毒性T细胞)应答。其中未考虑抗体介导的免疫应答(体液免疫)，并且在这个意义上未提供结果。此外，其中通过测量用野生型李斯特菌攻击之后感染小鼠的脾中的细菌计数来确定这种突变体的保护效果。在这个意义上，只有在进行存活测定时才可以评价疫苗针对急性和致死性细菌感染(特别是引起脓毒的那些)的有效性。此外，其中没有D-丙氨酸注射的突变体李斯特菌描述为提供很少保护。相比之下，当在突变生物体的初始接种物中补充D-丙氨酸以达到与野生型菌株相同的保护时(在初始免疫接种时)，这具有减少突变体的致死剂量约10倍的效果，如果考虑减毒的损失这是这种突变体的安本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含D‑谷氨酸营养缺陷型突变体活细菌菌株的药物组合物(优选疫苗)的方法，其中所述药物组合物适合用于动物和/或人针对所述组合物的营养缺陷型突变体细菌菌株的野生型形式的感染的预防性治疗(感染之前)和/或治疗性治疗(感染之后或感染所引起的疾病临床表现之后)，并且其中所述药物组合物通过包括以下步骤的方法制备：a.获得D‑谷氨酸营养缺陷型突变体活细菌菌株；b.将所述营养缺陷型突变体活细菌菌株加入到药学可接受的载体或稀释剂并任选地添加佐剂；以及c.任选地冷冻干燥所述药物组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.25 EP 14382153.6;2013.10.11 ES P2013315041.一种制备包含D-谷氨酸营养缺陷型突变体活细菌菌株的药物组合物(优选疫苗)的方法，其中所述药物组合物适合用于动物和/或人针对所述组合物的营养缺陷型突变体细菌菌株的野生型形式的感染的预防性治疗(感染之前)和/或治疗性治疗(感染之后或感染所引起的疾病临床表现之后)，并且其中所述药物组合物通过包括以下步骤的方法制备：a.获得D-谷氨酸营养缺陷型突变体活细菌菌株；b.将所述营养缺陷型突变体活细菌菌株加入到药学可接受的载体或稀释剂并任选地添加佐剂；以及c.任选地冷冻干燥所述药物组合物。2.一种制备包含D-谷氨酸营养缺陷型突变体活细菌菌株的药物组合物(优选疫苗)的方法，其中所述药物组合物适合用于动物和/或人针对所述组合物的营养缺陷型突变体细菌菌株的野生型形式的感染的预防性(感染之前)和/或治疗性治疗(感染之后)，并且其中所述药物组合物通过包括以下步骤的方法制备：a.提供能够表达谷氨酸消旋酶和可能的D-氨基酸转氨酶且包含肽聚糖细胞壁的细菌菌株；b.以使得所述细菌菌株不再能够表达功能性谷氨酸消旋酶和/或功能性D-氨基酸转氨酶的方式失活编码谷氨酸消旋酶的一个基因或多个基因，以及如果需要，失活编码酶D-氨基酸转氨酶的一个基因或多个基因，其中所述基因的失活因此导致所述细菌菌株成为D-谷氨酸营养缺陷型；以及c.将所述营养缺陷型突变体活细菌菌株加入到药学可接受的载体或稀释剂并任选地添加佐剂；以及d.任选地冷冻干燥所述药物组合物。3.权利要求1或2的制备药物组合物的方法，其中所述药物组合物为疫苗，并且所述制备方法包括添加佐剂。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述步骤a)的细菌菌株为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。5.权利要求2的方法，其中所述步骤a)的细菌菌株具有谷氨酸消旋酶作为D-谷氨酸合成的唯一方式，并且其中所述方法的步骤b)包括失活编码这种酶，即谷氨酸消旋酶的基因。6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述步骤a)的细菌菌株选自由以下组成的细菌物种列表：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacter baylyi、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、Acinetobacter nosocomialis、Acinetobacter pittii、抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)、李氏放线杆菌(Actinobacillus lignieresii)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、Aeromonas veronii subsp.Sobria、伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)、Arcobacter butzleri、Arcobacter nitrofigilis、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、Bacillusbataviensis、解纤维芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)、鸟博德特氏菌(Bordetellaavium)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusis)、Bordetella petrii、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、Burkholderiamultivorans、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、Burkholderiathailandensis、简明弯曲菌(Campylobacter concisus)、胎儿弯曲菌胎儿亚种(Campylobacter fetus subsp.fetus)、胎儿弯曲菌性病亚种(Campylobacter fetussubsp.venerealis)、纤细弯曲菌(Campylobacter gracilis)、Campylobacter hominis、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、昭和弯曲菌(Campylobacter showae)、乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、Clostridiumasparagiforme、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、Clostridium saccharobutylicum、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大肠杆菌、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)、马生殖道嗜血杆菌(Haemophilus equigenitalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophilus pleuropneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa)、伊林钩端螺旋体(Leptospira illini)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)、摩根氏菌(Morganella morganii)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium 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dysgalactiae)、停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)、马链球菌(Streptococcusequi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、Streptococcus zooepidermicus、Taylorella asinigenitalis、马生殖道泰勒氏菌(Taylorella equigenitalis)、品他病密螺旋体(Treponema carateum)、家兔密螺旋体(Treponema cuniculi)、Treponemahyodisenteriae、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、Treponema suis...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·布阿雷瓦洛，M·C·波沃阿卡布拉尔，A·佩雷斯戈麦斯，M·梅里诺卡瓦列拉，A·贝塞罗卡萨斯，P·加尔科拉费尔南德斯，
申请(专利权)人：加利西亚健康服务SERGAS，诺沃亚桑托斯教授基金会，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES