本发明专利技术涉及路德维希肠杆菌BG10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用。路德维希肠杆菌BG10-1于2016年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2016014，分类命名：Enterobacter Ludwiggi BG10-1。路德维希肠杆菌BG10-1是从广西贺州八步镇花生荚果中分离获得。经室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株对黄曲霉菌抑菌能力较强，容易培养，无污染，对环境安全。施用本微生物菌肥能有效防治黄曲霉菌对花生的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一株路德维希肠杆菌BG10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用。
技术介绍
由曲霉属真菌（特别是黄曲霉）引起的毒素污染统称曲霉菌毒素污染，寄主范围 广。曲霉特别是黄曲霉给花生、玉米、水稻及大豆等作物的安全生产带来严重危害，每年导 致的经济损失高达数百亿美元。曲霉属真菌特别是黄曲霉菌能产生毒性极强的真菌毒素。 黄曲霉毒素是广泛污染农产品的一类强致癌、剧毒性真菌毒素，包括B、G和Μ族，其中B1最普 遍且毒性最强。人或动物食用受毒素污染的食品或饲料后会导致机体病变甚至死亡，严重 威胁消费者健康与生命安全，制约农业产业发展与国际贸易。因此，加强我国花生、玉米及 水稻等农产品中黄曲霉及毒素污染的防控刻不容缓。 目前，在对黄曲霉菌的防治中，化学防治占据重要的地位。化学防治不但成本高， 且易污染环境，在防控病原菌的同时病原菌也易对化学药剂产生耐药性甚至抗药性。因此， 加强黄曲霉菌生物防控的研究对我国农业产业及经济效益具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的之一是针对花生中黄曲霉菌污染的问题及现有技术的不足，提 供一株对黄曲霉菌有较好防效的路德维希肠杆菌菌株。[000引本专利技术的另一专利技术目的是提供由该菌株制备的微生物有机肥制剂、制备方法及其 在黄曲霉菌生物防治中的应用。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为： 提供路德维希肠杆菌BG10-1，已于2016年1月7日保藏于中国武汉大学的中国典型 培养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016014,分类命名：Enterobacter Ludwigii BG10-1。路德维希肠杆菌BG10-1是从广西贺州八步镇花生芙果中分离获得。经室 内对時括抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株对黄曲霉菌抑菌能力较 强，容易培养，无污染，对环境安全。[000引路德维希肠杆菌BG10-1菌株的分离及筛选方法如下：选取罹病花生田中健康花生植株，连同花生植株及±壤一同带回实验室分离。超 净工作台上将花生植株上部长有叶片的茎杆剪掉，轻轻抖掉芙果上附着且结合程度低的± 壤，将健康芙果及其上附着牢固的±壤一起放入无菌水中，震荡30分钟，获得±壤悬浮液。 将芙果从上述±壤悬浮液中无菌操作取出，用吸水纸吸干后用綴子夹至无菌天平上称重。 将称重后的花生芙果用自来水及牙刷洗净表面±壤至眼睛看不见为止，然后在无菌Ξ角 瓶中用3%次氯酸钢溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，渐干水分。用綴子夹出花生芙 果，无菌操作斑开芙果，将果壳用无菌剪刀平均分成5等份，分别放置在牛肉膏蛋白腺培养 基、PDA培养基平板中，于28Γ恒溫培养，每天观察菌落生长状况，并及时挑取特征差异明 显、分离良好的单菌落，进一步纯化获得纯菌株，在牛肉膏蛋白腺斜面培养基上保藏备用。 进行室内对時括抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验，从中筛选获得路德维希肠杆 菌BG10-1。 路德维希肠杆菌BG10-1形态学特征： 对BG10-1细胞形态和菌落特征进行观察，均为革兰氏阴性短杆菌，无芽抱，好氧， 菌落圆形，较小，边缘整齐，表明湿润粘稠，菌落乳白色。[001引生理生化特征； 各项生理生化鉴定项目包括:革兰氏染色、氧化酶反应、过氧化氨酶反应、葡萄糖 发酵、V.P检巧U、MR检巧Μ千维素分解、巧樣酸盐利用、酪蛋白水解、硝酸盐还原、亚硝酸盐还 原、硝化反应及硫化氨反应等。路德维希肠杆菌的主要生物学特性为见表1。 表1路德维希肠杆菌BG10-1生理生化特征 生防菌BG10-1分子鉴定为路德维希肠杆菌，其16srDNA基因序列见说明书核巧酸 和氨基酸序列表中的SEQ. ID.NO. 1。 路德维希肠杆菌BGlO-1菌株的生物活性测定： (1)路德维希肠杆菌BG10-1对黄曲霉菌的抑制作用:采用对時培养法对黄曲霉菌内 生括抗细菌进行筛选。将预先准备好的黄曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫灭菌的 牙签薩取内生细菌，等距离(距病原菌2cm处)对称点接到PDA平板上，于28°C黑暗培养，3- 7d观察抑菌带的有无及大小，重复3次。选出抑菌带较宽的内生细菌菌株在花生颗粒上进行 复筛。表巧旨出所应用的效果较好的生防菌对黄曲霉菌的抑制率，所实验的325株菌株中， BG10-1菌株对黄曲霉菌的抑制作用最强，抑制率达到72.5% (图1)。 表2路德维希肠杆菌BG10-1等生防菌株对黄曲霉菌的抑制率（％ ) 注:表中的实验数据为Ξ次重复的平均值。 间菌株BG10-1等生防菌活体生防效果实验 ①括抗菌发酵液的准备：用挑针挑取离体试验中具有抑菌活性的括抗细菌菌株 BG10-1等菌株的单菌落，转移至装有50mL ΝΒ培养液的Ξ角瓶中，于28°C、150r · min-i振荡 培养Id。吸ImL培养液转接至装有50mL NB培养液的Ξ角瓶中，28°C、150r · min-i振荡培养 2d，获得括抗菌株的发酵液。 ②括抗细菌的活体筛选:把上述发酵2天的括抗菌发酵液(抱子最终浓度为3.0X 106抱子?血-1)和培养7天生长旺盛的黄曲霉菌菌悬液(抱子最终浓度为3.0X 106抱子· mL 分别浸泡花生种30min，阴凉处被干后放入无菌平板，每板20粒花生，放入光照培养箱培 养1 Od。培养箱培养条件为:溫度28 °C，湿度70-80 %，光照为12h黑暗/1化光照。W不浸黄曲 霉菌液为空白对照，每处理设3次重复。表3指出菌株BG10-1抑制率及抑毒率最高，分别达到 65.0%及90.5%，该菌株有进一步研究的潜力(表3和图2)。抑毒率（％ )=(对照毒素量一处 理毒素量)/对照毒素量X 100% ;抑制率（％ )=(对照发病数一处理发病数)/对照发病数X 100%。 表3 7株括抗菌对黄曲霉菌的防治效果及抑毒率 注:数据为Ξ次重复的平均值 提供一种由上述路德维希肠杆菌BG10-1制成的防治花生黄曲霉菌的微生物有机 肥制剂，括抗菌含量在5X108c化/gW上，有机质含量为35-40wt%。 其生产方法包括： 将路德维希肠杆菌BG10-1发酵液和木馨渣与畜禽粪便混合物高溫腐熟料进行固 体发酵，发酵两天后进行翻料，W后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束，低溫干燥（< 60 °C)，使其含水量含18%即可得到包装成品固体发酵微生物有机肥，固体发酵微生物有机肥 中括抗菌含量达5 X 108c化/gW上，有机质含量为35-40wt%。 按上述方案，木馨渣与畜禽粪便混合物高溫腐熟料:发芽指数^ 98%，有机质含量 35-40wt%，含水量 15-20wt%。 按上述方案，将路德维希肠杆菌BG10-1接种到液体培养基中进行发酵生产，发酵 生产的条件为:培养溫度32-35°C，pH 7.0-7.2，揽拌速度180-220rpm，发酵后使发酵液中菌 体量达到 Μ X l〇iDcfu/ml。 按上述方案，每吨木馨渣与畜禽粪便混合物高溫腐熟料中加入路德维希肠杆菌发 酵液15-3化。 按上述方案，所用的液体培养基配制方法为：玉米粉3.0-3.5**%、蛋白腺1.5- 2. Owt %、K2HPO4+KH2PO4(1:1)0.4-0.5wt %，水 1000ml，pH 7.0-7.2，12rC 灭菌20min。 路本文档来自技高网...
【技术保护点】
路德维希肠杆菌BG10‑1，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2016014。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，姚彦坡，丁小霞，张奇，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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