本发明专利技术公开了一种用VCAM‑1检测MSC促内皮细胞增殖能力的方法，其特征在于发现了一种已知蛋白VCAM‑1的新用途，通过EL I SA检测VCAM‑1的蛋白表达，用Bradford法测定总蛋白含量，利用每1g总蛋白中VCAM‑1的蛋白含量来反映细胞的促内皮细胞增殖能力，以此方法可以对MSC的促内皮细胞增殖能力进行定量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞领域，具体而言，涉及用VCAM-1 (血管细胞粘附分子-1)检测MSC (间充质干细胞)促血管新生能力的方法。
技术介绍
血管内皮细胞粘附分子-l(VCAM-l)，也称为⑶106,是一种属于免疫球蛋白超家族 的细胞表面唾液酸糖蛋白。VCAM-1有两个亚型，具有六个或七个由选择性剪接产生两种形 式的VCAM-1的胞外Ig样结构域，主要的存在形式是具有七个胞外Ig样结构域的亚型。VCAM-1是一种内皮细胞配体，与白细胞上表达的VLA-4抗原和α4β7整合素结合，从而介导白细胞-内皮细胞粘附和信号转导。炎症性肠病，动脉粥样硬化，同种异体移植物排斥，感染和哮喘 反映中内皮细胞上VCAM-1被诱导表达。在这些反映中，VCAM-1为白细胞迀移构成一个支架。 VCAM-1也可以激活内皮细胞内的信号导致的"内皮细胞门"的开启，通过它白细胞得以迀 移。VCAM-1已经被认为是一种潜在的抗炎治疗靶点，减少VCAM-1的表达将减缓动脉粥样硬 化的发展。此外，在血管内皮细胞的VCAM-1激活的信号由细胞因子调控，这表明它在炎症过 程中对于内皮细胞粘附分子的表达和功能是很重要的。 VCAM-1在大多数静止内皮细胞低表达，在血管损伤、应激等情况下可被IL-1、TNF-a、IL_4等细胞因子诱导，主要表达于新生血管区。其体内的可溶形式通过介导内皮细胞趋 化而显示血管生成活性。 血管是人体的重要组成部分，血管生成(angiogenesis)是从已有血管发芽生成新 血管的过程，整个血管的内表面都是由一层内皮细胞所覆盖的，血管的生成与血管内皮细 胞迀移和增殖相关。 体内外实验证明MSC具有治疗性血管生成作用，它可以通过直接分化成内皮细胞 或者血管平滑肌细胞参与血管新生，另外它还能够分泌多种促血管形成因子，改善微环境， 促进血管内皮细胞增殖和迀移，进而促进血管新生。 MSC的促血管新生的特性对肢体缺血的治疗有着非常重要的临床意义。但是目前 缺乏检测和评价MSC的促血管新生能力的方法，阻碍了细胞的临床应用。 本专利技术的专利技术人通过研究发现，MSC的促血管新生能力中，VCAM-1表现出高度的相 关性，基于这一发现专利技术了本专利技术。 本专利技术的目的在于提供一种全新的、能够有效检测MSC促血管新生能力的方法。
技术实现思路
本专利技术的第一技术方案为，一种用VCAM-1检测MSC促血管新生能力的方法，其特征 在于，检测MSC中VCAM-1的蛋白含量，测定总蛋白含量，根据总蛋白中的VCAM-1的蛋白含量 百分比来检测MSC的促血管新生能力。 第二技术方案为，基于第一技术方案，其特征在于，所述MSC为包含VCAM-1阳性的 MSC〇 第三技术方案为，基于第二技术方案，其特征在于， 步骤1，将MSC和内皮细胞共培养后，检测内皮细胞的增殖数，得到MSC促进内皮细 胞增殖率，步骤2,测定MSC的总蛋白含量， 步骤3，检测MSC的VCAM-1的蛋白含量， 步骤4,计算总蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比， 步骤5，应用统计学方法分析VCAM-1的蛋白含量百分比与步骤1中的MSC促进内皮 细胞增殖率之间的相关性，对VCAM-1的蛋白含量百分比与促血管新生能力之间的关系进行 定量。 第四技术方案为，基于第三技术方案，其特征在于，所述内皮细胞为HUVEC细胞。 第五技术方案为，基于第一至四中任一项技术方案，其特征在于，通过ELISA检测 VCAM-1的蛋白含量。第六技术方案为，基于第一至四中任一项技术方案，其特征在于，用Bradford法测 定总蛋白含量。第七技术方案为，基于第五技术方案，其特征在于，用Bradford法测定VCAM-1的蛋 白含量。【附图说明】通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通 技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术 的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字 之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附 图中：图1示出了不同MSC样品的促内皮增殖率；图2示出了不同MSC样品的每lg总蛋白中的VCAM-1的蛋白含量； 图3示出了不同MSC样品的促内皮增殖率与VCAM-1的蛋白含量之间的相关性； 图4示出了激光多普勒检测缺血下肢的血流灌注量。【具体实施方式】 本专利技术提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上 下文中。在下述本专利技术的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本专利技术的【具体实施方式】的 示例性说明，而不构成对本专利技术范围的限制。 以下对本专利技术的【具体实施方式】进行说明。步骤（1)在transwe 11体系中培养MSC和HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞），共培养后 检测HUVEC细胞的增殖数，得到MSC促进内皮细胞增殖率。 步骤(2)提取MSC的总蛋白，利用Bradford法测定总蛋白浓度。 步骤(3)利用ELISA试剂盒检测蛋白样本中VCAM-1的含量。步骤(4)计算每1 g总蛋白中的VCAM-1的蛋白含量(计算总蛋白中的VCAM-1的蛋白 含量百分比）。步骤(5)应用统计学方法分析VCAM-1的蛋白含量与促进HUVEC增殖率之间的相关 性。步骤(6)进行体内功能验证实验，确定VCAM-1对于MSC的促血管新生能力的作用。以下通过实施例对各步骤进行详细说明。 实施例步骤1.检测样品细胞的促内皮细胞增殖能力 在transwell体系的下腔中种植脐静脉内皮(HUVEC)细胞，在上腔中种植MSC细胞， 每组设定3个复孔，共培养后检测HUVEC的增殖数。因为内皮细胞是直接形成血管的细胞，通 过样品细胞(MSC)对内皮细胞的作用反映其促血管生成的作用。实验中选取了 8个不同个体 来源的MSC细胞进行实验，用于检测的细胞均为P5代，实验结果显示不同的细胞均不同程度 的促进HUVEC增殖，但是存在个体差异(图1 )，具体的数据见表一。 表一、不同样品细胞的促进HUVEC增殖率 步骤2、3、4.ELISA检测样品细胞的VCAM-1含量收集步骤1中的8个MSC细胞样本，裂解细胞进行总蛋白提取。利用Bradford法测定 总蛋白浓度(步骤2)，利用ELI SA试剂盒检测各个蛋白样本中VCAM-1的含量(步骤3、4)。实验 结果显示MSC细胞表达VCAM-1，每lg总蛋白中的VCAM-1含量均不相同（图2)。具体的数据见 表二。 表二、不同样品细胞的VCAM-1含量[0044」步骤5.细胞的VCAM-1含量与其促内皮细胞增殖能力的相夫性分析 将步骤1和3的数据进行相关性分析，结果表明细胞中VCAM-1含量高的MSC可以更 显著的促进HUVEC增殖率。即VCAM-1含量与促进HUVEC增殖率之间具有相关性，统计学分析 表明，Pearson相关系数= 0.9222，p = 0.0031，二者之间存在显著的正相关关系（图3)。因此 能够用总蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比来定量和检测MSC的促血管新生能力 步骤6.体内验证实验证明VCAM-1具有促血管新生能力 通过流式分选获得VCAM-1阳性的MSC和VCAM-1阴性的MSC，分别标注为VCAM-1+MSC 和VCAM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用VCAM‑1检测MSC促血管新生能力的方法，其特征在于，检测MSC中VCAM‑1的蛋白含量，测定总蛋白含量，根据总蛋白中的VCAM‑1的蛋白含量百分比来检测MSC的促血管新生能力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁璐，赵钦军，韩之海，
申请(专利权)人：北京汉氏联合生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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