一种栓菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种栓菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术的栓菌可产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，可以马铃薯提取液和葡萄糖为主要原料进行振荡培养发酵产酶。发酵产酶酶活可达：漆酶酶活63.6U/L，纤维素酶酶活1108.9U/L，半纤维素酶酶活3844.9U/L，果胶酶酶活52.7U/L。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于微生物发酵

技术介绍
微生物发酵技术通常是生产单一酶制剂，实际应用中又常常将几种酶复配后应 用，但各种酶的复配有可能会影响彼此的酶学性质，因此，发酵液含多种酶的体系能得到更 好的应用。 中国专利公布号CN102268379A，公布日2011年12月07日，专利技术名称为"一种毛 栓菌及其产纤维素酶的方法"，该专利技术公开了毛栓菌发酵产纤维素酶的方法，成功测得纤维 素酶酶活，该专利技术的不足之处在于粗酶液中仅含一种酶，较单一。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种可产多种酶的栓菌（Trametes sp. LEF01)及 其应用。 该菌于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏号为 CGMCC No. 10489。 所述栓菌可同时产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，可以马铃薯提取液和葡 萄糖为主要原料进行振荡培养发酵产酶。该菌发酵产酶，漆酶酶活4100. 8U/L，纤维素酶酶 活2310U/L，半纤维素酶酶活21271. 8U/L，果胶酶酶活19800U/L。 所述栓菌是从土壤中分离得到的。 本专利技术还提供一种利用所述栓菌发酵产酶的方法，是将栓菌CGMCC No. 10489活化 后，接入马铃薯液体培养基中，在28°C、150rpm的条件下振荡培养6天，离心取上清即得粗 酶液。 在本专利技术的一种实施方式中，所述粗酶液中含有漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果 胶酶粗酶。 在本专利技术的一种实施方式中，所述马铃薯液体培养基的制备方法：每L的配方，取 去皮马铃薯200g、切块、煮沸、过滤，然后补足至1L，并加入20.0 g葡萄糖。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：称取去皮马铃薯200g，切成小块， 加水1.0 L煮沸20~30min，4层纱布过滤滤去马铃薯块，将滤液补足至I. 0L，加入20.0 g葡 萄糖；分装后121°C高压灭菌20~30min后，冷却，无菌操作，接入在PDA斜面培养基上已培 养5~6天的CGMCC No. 10489菌株的菌悬液，在恒温振荡培养箱内28~30°C条件下振荡 培养6天，转速为150rpm，发酵结束，发酵液4000rpm离心30min，得到的上清液为粗酶液。 本专利技术还要求保护所述栓菌在生产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶方面的 应用，所述栓菌发酵生产得到的漆酶、纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶，以及所述栓菌在纺 织领域的应用。 本专利技术的有益效果： (1)本专利技术的栓菌培养基简单，原料主要为马铃薯和葡萄糖；培养操作容易，接种 后振荡培养。 (2)本专利技术得到的粗酶液为多种酶粗酶液体系，漆酶酶活4100. 8U/L，纤维素酶酶 活2310U/L，半纤维素酶酶活21271. 8U/L，果胶酶酶活19800U/L。本专利技术的菌株和粗酶液应 用前景大。 生物材料保藏： -种栓菌，分类学命名为栓菌Trametes sp.，于2015年5月18日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No. 10489,保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号。【附图说明】 图1.栓菌（Trametes sp. LEF01)的红色氧化圈； 图 2.栓菌（Trametes sp. LEF01)的发酵体系。【具体实施方式】 酶活测定方法： (1)漆酶酶活 定义：Imin内氧化ABTS生成1 μ mol ABTS自由基所需酶量为1个酶活单位。 测定方法：以ABTS (2, 2' -二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐）为底物测 定漆酶酶活，即取2mL 0· 5mmol/L ABTS溶液（用ρΗ5· 0,浓度为0· 05mol/L的醋酸-醋酸钠 缓冲液配制），空白样用等量缓冲溶液替代，37°C预热，加入ImL粗酶液，测定420nm处吸光 度变化率。漆酶酶活=吸光度变化率X反应液体积X1000X稀释倍数/摩尔吸光数。 (2)纤维素酶酶活 定义：Imin内产生1 μ mol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。 测定方法：利用DNS法（3, 5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶酶活，即取0. 2mL粗 酶液，加入I. 8mL质量分数0· 625%羧甲基纤维素钠（CMC-Na)溶液（用pH为4. 8,0· 2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制），空白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，于50°C反应30min 后立即加入2mL DNS试剂，沸水浴IOmin显色，冷却，稀释定容至一定倍数，充分混勾，测定 550nm处吸光度。纤维素酶酶活=葡萄糖浓度X反应液体积X1000X稀释倍数/反应时 间。 (3)半纤维素酶酶活 定义：Imin内产生1 μ mol木糖所需的酶量为1个酶活单位。 测定方法：利用DNS法测定半纤维素酶酶活，即取ImL粗酶液，加入2mL质量分数 为0. 5 %的木聚糖悬浮液（用pH4. 8,浓度0. 05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制），空 白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在60°C下处理30min后立即加入2mLDNS试剂终止 反应，沸水浴IOmin显色，冷却至室温，稀释定容至适当体积，混合均匀后测定540nm处吸光 度。半纤维素酶酶活计算方法为：根据木糖标准曲线得到木糖浓度，半纤维素酶酶活=木糖 浓度X反应液体积X 1000X稀释倍数/反应时间。 (4)果胶酶酶活 定义：Imin内使聚半乳糖醛酸催化裂解产生1 μ mol不饱和半乳糖醛酸的酶量。 测定方法：以果胶为底物测定果胶酶酶活，即取ImL粗酶液，加入2mL 0. 2%果胶 的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（PH9. 4)，空白样加入等量pH9. 4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液， 45°C水浴中反应15min，加入0· 03mol/L的磷酸3mL，测定235nm处吸光值。果胶酶酶活计 算方法为：果胶酶酶活=酶活测定值X反应液体积X1000X稀释倍数/反应时间。 实施例1 :栓菌的分离与鉴定 样品采集自无锡长广溪国家湿地公园的土壤，溶于生理盐水（0.9%氯化钠溶 液），4000rpm离心15min。取上清液ImL溶于9mL无菌水中，依次稀释10~IO 5倍，倒入PDA 平板培养基上，培养2~3天。挑取单菌落接种到PDA-愈创木酚培养基上（添加0. 01 %愈 创木酚的PDA培养基）进行复筛，选取出现红色氧化圈的菌落（图1)，接种到PDA斜面上保 存。 对该菌株进行基因组DNA抽提，PCR扩增及纯化、测序（结果如SEQ ID NO: 1所 示），鉴定为栓菌属（Trametes)，命名为Trametes sp.LEFOl。该菌株已于2015年5月 18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No.10489。 实施例2 :栓菌发酵产酶 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0 L煮沸30min，4层纱布过滤滤去马铃薯 块，将滤液补足至1.〇1，加入20.08葡萄糖。分装后121°(：高压灭菌2〇1^11后，冷却，无菌操 作，接入在PDA斜面培养基上已培养5~6天的Trametes sp. LEFOl菌株的菌悬液，在恒温 振荡培养箱内28°C条件下振荡培养6天，转速为150rpm，发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种栓菌，于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.10489。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，张颖，范雪荣，邵奕文，王平，袁久刚，余圆圆，崔莉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32