一种对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应的方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应的方法，其包括以下步骤：(1)以同一母性家禽所孵化的幼禽为单位，对每一家系编号，每窝中的2只幼禽的胎粪合并作为一个检测样本，将检测样本加入含缓冲液的样品采集管中；(2)将样品采集管放入保温盒中并加入液氮，完全冰冻后取出；(3)水浴恒温融化，并混匀；(4)重复(2)-(3)一次；(5)室温下，将步骤(4)处理完成的检测样本的上清液分别加入到预先包被了针对ALV病毒P27蛋白的一组特异性单克隆抗体的检测试纸条的加样端进行特异性反应；(6)采取家系淘汰制淘汰。本发明专利技术的方法能够快速、高效的检测胎粪中禽白血病病毒抗原，且节约成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应 的方法，
技术介绍
禽白血病（avian leukemia，AL)是由禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV) 引起的家禽肿瘤性疾病。ALV在各类鸡群都广泛性感染，包括白鸡、蛋鸡和地方黄鸡。对ALV 的防控措施，只有通过疾病净化，没有其它更好的捷径。ALV既可以水平传播，也可以垂直传 播。对育种企业而言，垂直传播的危害性更大。在禽白血病的垂直传播环节中，以1日龄胎 粪的载毒量最高，横向传染性最强，所以胎粪ALV病毒的检测和阳性雏鸡的淘汰是AL净化 流程中最重要的核心环节。 目前国内外的家禽育种企业在大批量鉴定胎粪ALV的免疫学方法主要以EL ISA (酶联免疫吸附实验）为主，以间接免疫荧光（IFA)、PCR为辅。以上各种方法虽然可能 在临床上提供一定的帮助，但因操作过程较为繁琐，效率较低。以2000羽雏鸡的规模计算， 该环节传统的ELISA检测与淘汰方法大致需要20小时，整个胎粪ALV检测/淘汰环节时间 冗长，导致初生苗鸡在长时间等待检测结果、高密度集中存放状态下容易出现脱水，同时导 致其它病原（特别是垂直传播的病原和1日龄横向传播的病原）在雏鸡之间交叉感染几率 增大，同时生产技术人员疲惫，效率较低。因此有必要建立一种快速高效的现场诊断鸡群胎 粪ALV的方法，对临床的操作具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术主要提供了一种对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应的方法，该检测方法能 够快速、高效的检测禽白血病，且节约成本。具体技术方案如下：一种对胎粪ALV病毒P27 蛋白快速反应的方法，包括以下步骤： (1)以同一母性家禽所孵化出的幼禽为单位，一窝即为一个家系，对每一家系单独 编号，每一窝中的2只幼禽的胎粪合并作为一个检测样本，将检测样本加入含有缓冲液的 样品采集管中； (2)将样品采集管放入保温盒中，向保温盒中加入液氮，待检测样本完全冰冻后取 出； (3)将步骤（2)冰冻的检测样本放入水浴锅中恒温融化，并混匀； (4)重复步骤（2)-(3) -次； (5)室温下，将步骤（4)处理完成的检测样本的上清液分别加入到预先包被了针 对ALV病毒P27蛋白的一组特异性单克隆抗体的检测试纸条的加样端进行特异性反应； (6)反应完全后，采取家系淘汰制，即同一只家禽的种蛋孵出的幼禽，若有一只出 现胎粪检测ALV阳性，则该窝幼禽全部淘汰。 优选的，步骤（2)中冰冻时间为2-4min。 优选的，步骤（3)中恒温融化时间为2-4min。 优选的，步骤（6)中反应完全的时间为5-10min。 优选的，所述家禽为鸡、鸭、鹅。 采用上述对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应的方法，本专利技术具有以下优点： (1)本专利技术的反应方法中，将幼禽逐只采集胎粪检测提升为两只幼禽的胎粪合并 检测，检测灵敏度高，节省大量的人力和物力； (2)本专利技术的反应方法采取家系淘汰制，即一只母性家禽的种蛋孵出的幼禽为一 窝，只要有一只出现ALV阳性，即淘汰该窝所有幼禽，减少垂直传播的危害性，这只需对同 一家系进行同一编号即可，避免了对所有幼禽进行逐一编号的弊端，极大的缩减了采样编 号时长，同时避免了现有的穿刺编号对幼禽的刺激，减少编号费用的投入，节省人力物力； (3)本专利技术的反应方法中采用快速冻融的方法，传统的冻融方法耗时需4小时之 久，导致初生苗鸡长时间脱水、高密度雏苗等待检测结果时集中存放导致其它病原容易相 互传染，而本专利技术中冻融一次只需6min左右，极大地缩减检测时长，同时避免操作时间过 长对试验的影响，能够快速、高效的检测胎粪中禽白血病病毒抗原。【具体实施方式】 一、具体实施例 实施例1 以检测黄羽肉鸡的ALV病毒为例，下述的检测方法同样适用于其它的禽类ALV病 毒检测。 1.胎粪采集及冻融 (1)物品的准备：样品采集专用的耐冻融样品盒（含底带盖），装满液氮的液氮罐 2个，带盖保温盒3个，水浴锅，专用的样品稀释裂解液； (2)样品采集：以窝（同一母鸡所孵化出的雏鸡）为单位，每一个家系单独编号。 同时根据本研究的定量研究结果，每2只雏鸡的胎粪合并到一个含专用采样缓冲液的样品 采集管内，这比传统方法（逐只单样品收集）节省一半的检测费用和的大量后续的人力物 力；（3)快速冻融样品：收到样品后将盒子的底部壳子去掉，只将盖子和样品部分放入特定 保温盒中，使用容器往泡沫盒中添加液氮，迅速用保温盒的盖子盖住。待样品全部冰冻后取 出，冷冻过程大约需要2-4min ; (4)迅速融化样品：预先调整水浴锅温度到37°C，将上述冷冻的样品原样（样 品部分及盖子）放入水浴锅中，并颠倒混匀，待样品全部融化后取出，融化过程大约需要 2_4min ; (5)重复冻融：上述（3)-⑷步骤； 以冻融一盒样本为例，整个冻融环节总共需要15min，比零下70°C冰箱冻融的传 统方法（约4h)，节约时间三个多小时。 2.胎粪ALV的快速检测 (1)物品准备：冻融过两次的胎粪样品，小型一次性塑料吸管，检测试剂和平板 (摆放试纸条）。 (2)将预先包被了针对ALV病毒P27蛋白的一组特异性单克隆抗体的检测试纸条 并行排列在检测平板。使用一次性小塑料吸管，按样品摆放顺序滴加200微升（4滴）样品 (上清）到检测条的加样端，一般在室温（20-25度）下反应5-10分钟判断结果。如果操 作时间过长（> 10~20min)，会引起非特异反应。熟练操作人员加样50个，需时间大约 5-6min〇 (3)安排技术员进行结果判断：每50个样本在加样结束后即可判定（加样约 5min)，同时在记录纸上记录此时间点的结果，剩余样本需放置2~5min再判定（加样结束 后 5min)〇 (4)淘汰环节：采取家系淘汰，即同一只母鸡的种蛋孵出的苗鸡，只要有一只出现 胎粪检测ALV阳性，即该母鸡的所产的其他苗鸡全部淘汰。 3.操作注意点 (1)为保障整个检测系统的稳定，避免一些非特异因素的干扰，对每批检测试剂， 用病毒衣壳蛋白P27基因表达产物作为阳性对照、将新鲜配制的采样缓冲液和纯水（5份） 作为阴性对照进行验证，正常情况在5-10min内P27蛋白为阳性、采样缓冲液和纯水均为阴 性。检测试剂的保存，室温（25°C左右），时间不要超过2个月。 (2)加样时注意不要吸取有杂质的部分，防止太黏导致样品蛋白在检测试纸条上 不能迀移。 (3)不同家系鸡群，注意吸管的更换，避免交叉污染。 (4)样本加完后放回原处，等结果判定无误后再弃掉。 (5)判定时光照要强，太弱会影响结果判定。 (6)阳性鸡群标记与处理：每个家系的鸡群中，有一个以上出现阳性，用红笔标 记，必须淘汰。 二、检测效果的评估 由于慢速型中国地方黄羽肉鸡ALV病毒排毒时间点的不确定性，很少做胎粪检测 和淘汰效果的系统评估。本技术体系则根据前期研究结果，建立了胎粪检测淘汰效果的评 估技术。 具体技术细节如下： (1)选取慢速黄羽肉鸡种鸡群的未检测胎粪组和检测胎粪组，分别跟踪4周龄、6 周龄、8周龄，采样用于检测肠粘膜排毒（肠毒）和血淋巴细胞病毒（血毒）阳性率； (2)血毒和肠毒检测：血毒检测法是，将血淋巴细胞直接接种鸡胚成纤维细胞系 DF1细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对胎粪ALV病毒P27蛋白快速反应的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以同一母性家禽所孵化出的幼禽为单位，一窝即为一个家系，对每一家系单独编号，每一窝中的2只幼禽的胎粪合并作为一个检测样本，将检测样本加入含有缓冲液的样品采集管中；(2)将样品采集管放入保温盒中，向保温盒中加入液氮，待检测样本完全冰冻后取出；(3)将步骤(2)冰冻的检测样本放入水浴锅中恒温融化，并混匀；(4)重复步骤(2)‑(3)一次；(5)室温下，将步骤(4)处理完成的检测样本的上清液分别加入到预先包被了针对ALV病毒P27蛋白的一组特异性单克隆抗体的检测试纸条的加样端进行特异性反应；(6)反应完全后，采取家系淘汰制，即同一只家禽的种蛋孵出的幼禽，若有一只出现胎粪检测ALV阳性，则该窝幼禽全部淘汰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘岳龙，秦爱建，尹丽萍，缪伟，庄新娟，朱江宁，程立力，钱琨，邵红霞，梁有志，杨铜，戎双琳，辜新贵，
申请(专利权)人：江苏立华牧业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32