一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体地涉及一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法。一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；编码该重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将本发明专利技术的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体地涉及一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法。
技术介绍
水泡性口炎(Vesicularstomatitis,VS)是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)将VS列为法定报告传染病。目前，VSV分为两个血清型，即印第安纳(Indiana,IN型)和新泽西(NewJersey,NJ型)。VSV的感染谱很广，牛、猪、马、羊和其它多种野生动物可感染,人也可以感染VSV，并出现急性热性类似流感的症状。动物感染VSV发病后，临床症状与口蹄疫(FMD)症状非常相似，很难根据临床症状作鉴别诊断。水泡性口炎严重影响反刍动物养殖业的健康发展及相关动物和动物产品的国际贸易，对疫区造成巨大的经济损失。VSV为单股负链RNA病毒，基因全长11163bp，共编码5种主要病毒蛋白，包括糖蛋白(G)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)、磷酸蛋白(NS)、病毒RNA聚合酶(L)。其中N蛋白由422个氨基酸组成，呈现群特异性，为所有型的VSV所共有，诱导产生非中和抗体，与其它弹状病毒无任何交叉反应，因此VSVN蛋白是作为建立VSV抗体免疫学检测方法的重要抗原。目前，可用于水泡性口炎病毒抗体检测的方法有琼脂扩散试验(AGID)和竞争ELISA方法。由于琼脂扩散试验特异性较差，需要时间长等因素的制约，该方法在基层兽医部门很少应用。竞争ELISA具有较好的特异性和敏感性，可用于实验室检测。但由于ELISA检测需要专门的仪器设备和技术操作人员，在条件较好的实验室才可以得到应用。另外，目前国内没有商品化的ELISA试剂盒。申请号为200910190437.5的专利技术公开了一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法，但其是检测水泡性口炎病毒，即检测抗原，准确性不高。申请号为200410008749.7的专利技术公开了一种水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体、表达抗原以及制备方法，该专利技术使用的是水泡性口炎病毒N蛋白全基因，蛋白表达量并不高。申请号为201010182429.9的专利技术公开了一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法，该专利技术虽是检测水泡性口炎病毒抗体，但使用抗原为VSV全病毒抗原，特异性较差。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术公开了一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制作方法。本专利技术的内容包括一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQIDNo.1所示。进一步地，本专利技术的内容还包括编码所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步地，本专利技术还包括所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：1)人工合成SEQIDNo.2所示基因序列，并将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；2)将步骤1)获得的PCR产物与载体连接，构建重组表达载体；3)将重组表达载体导入原核表达体系，进行蛋白表达；4)对表达产物进行纯化后获得所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。进一步地，所述步骤1)中的PCR方法，其用于该PCR方法的PCR引物组，具体包括以下两条序列：上游引物P1见序列表中SEQIDNo.3；下游引物P2见序列表中SEQIDNo.4。进一步地，本专利技术的内容还包括所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原在制备用于检测水泡性口炎病毒抗体的试剂中的应用。本专利技术针对水泡性口炎水泡性口炎病毒N蛋白氨基酸序列，通过抗原表位分析和密码子优化获得截短并优化后的VSVN基因序列，通过人工合成该序列并在原核表达体系表达该基因，获得水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。相对于先有技术，本专利技术的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原具有更好的抗原特性，且优化后的基因序列在表达体系中蛋白表达量高，效果好。将本专利技术的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。附图说明图1为SDS-PAGE(左图)和Western-blot(右图)分析基因表达的VSVN蛋白。其中，M：蛋白分子量标准；1：转化pET52/LIC质粒的对照菌；2，4：转化pET52/LIC-mVSVN质粒的阳性菌(含密码子优化后的VSVN基因序列)；3，5：转化pET52/LIC-VSVN质粒的阳性菌(含密码子未优化后的VSVN基因序列)。图2为水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条结构示意图。其中，1：背衬，2：硝酸纤维素膜，3：样品垫，4：金标复合物垫，5：吸水垫，6：检测线，7：对照线。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1：截短的VSVN蛋白的表达1、VSVN蛋白抗原表位分析和密码子优化：通过检索NCBI数据库中VSVN基因序列和对应氨基酸序列(GenBank:J02428.1)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定选择抗原表位位于N蛋白中第88～374位氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNo.1，其对应的核苷酸序列(GenBank:J02428.1)为第325～1185nt位核苷酸，见序列表SEQIDNo.5。2、VSVN基因密码子优化和人工合成：密码子优化，即根据表达系统对氨基酸密码子的偏爱性，对基因序列进行重新设计，将基因序列中利用率低或稀有的密码子修改为表达系统使用频繁的密码子，确保所表达蛋白的氨基酸序列不变。根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对选取的蛋白质片段对应的基因序列密码子进行优化，优化后的基因序列标记为mVSVN，其序列为序列表中SEQIDNo.2，通过人工合成该序列，将该序列克隆至pMD-18T载体中。3、mVSVN基因引物设计：根据密码子优化后的VSVN基因序列，设计特异性引物，在引物5'端人工添加LIC粘性末端，与商品化线性pET52/LIC末端互补的序列。PCR引物序列如下，下划线部分为LIC粘性末端：上游引物(P1)：5'-CAGGGACCCGGTTGGTCAAGTTTCGGAATC-3'(SEQIDNo.3)；下游引物(P2)：5'-GGCACCAGAGCGTTATCACGACCTTGTGGTGG-3'(SEQIDNo.4)；4、PCR扩增mVSVN基因：用PCR扩增试剂盒(Takara公司产品)，从pMD-18T-mVSVN质粒中扩增目的基因片段。在PCR管中加入以下组分：将上述组分混合后置于PCR仪中，进行扩增。反应程序为95℃预变性5min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃10min。经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物约为890bp，用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物。5、pET52/LIC-mVSVN重组表达载体的构建：用T4DNA聚合酶处理的上述PCR产物与商品化线性pET52/LIc载体(Invitrogen公司产品)连接，利用T4DNA聚合酶外切酶活性，切去3'端约11～12个碱基，即形成与LIC位点序列互本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
2015.08.21 CN 20151051995291.一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQIDNo.1所示。2.编码权利要求1所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.权利要求1所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：1)人工合成SEQIDNo.2所示基因序列，并将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；2)将步骤1)获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙洁，杨俊兴，廖立珊，刘建利，花群义，吕建强，张彩虹，曾少灵，阮周曦，陶虹，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44