本发明专利技术公开了一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，本发明专利技术从山西省苹果产区临汾市苹果园的果树枝干上分离筛选获得2株抑制苹果树腐烂病菌较好的菌株LF17、LF18，经菌株菌落特征、菌株显微特征及16SrDNA序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。通过以下步骤制备生防菌发酵液：S1、培养基的制备：S2、拮抗菌株的活化：S3、拮抗菌株的液体培养：S4、过滤浓缩发酵液；S5、拮抗菌发酵液田间防治药剂的制备；S6、拮抗菌发酵液膏剂田间防治药剂的制备。本发明专利技术所得的生防菌发酵液可有效防治苹果腐烂病，对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性、伤口愈合快、病疤复发率低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及苹果树腐烂病的防治领域，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的生防菌 发酵液的制备方法。
技术介绍
苹果树腐烂病是我国苹果产区危害较严重的病害之一。该病引起苹果树树皮腐 烂、树势衰弱、苹果产量和品质下降；严重时引起主杆以致整树枯死，甚至造成毁园。当前， 腐烂病严重制约着苹果产业的发展。农业部苹果现代产业技术体系调查表明：苹果树腐烂 病总体发病率达52. 7%。随着树龄的增大，腐烂病发病株率提高，4-10年生果树株发病率 为26. 8 %，11-17年树龄的果树株发病率为54. 0 %，18-24年生果树株发病率为59. 3 %。当 前，生产上主要使用化学药剂防治苹果树腐烂病病。然而，长期大量使用化学药剂不仅使果 园生态环境恶化并给食品安全带来极大隐患，而且容易导致腐烂病菌抗药性菌株的出现。 尽管化学药剂在农业生产仍占主导地位，但寻求对环境友好且高效的防治方法已成为亟待 解决的问题。 生物防治技术作为一种安全有效的防治措施越来越受到人们的关注。国内外学者 先后报道哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、深绿木霉（Trichoderma atroviride)、螺旋 毛壳（Chaetomium spirale)、内生放线菌、链霉菌等对苹果树腐烂病菌具有诘抗作用。目 前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌（Bacillus)、假单胞杆菌（Pseudomonas)、土壤放 射杆菌（Agrobacterium radiobacter)等。其中，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)是 一种革兰氏阳性杆状细菌；其抑菌范围很广（包括番茄叶病、枯萎病、黄瓜枯萎病、霜霉病、 灰霉病、白粉病、腐烂病等），是一种理想的生防微生物。枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相 对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，符合现代社会对农业生产及有害生物综合 防治（IPM)的要求。 然而不同来源的枯草芽孢杆菌（B. subtilis)菌株生长过程中产生的枯草菌素、 多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质含量差异较大，导致不同来源枯草芽孢杆菌菌株 在抑菌效果方面表现出显著差异性。此外，单纯生防菌发酵液防治苹果树腐烂病存在防治 效果不稳定、拮抗菌抑菌物如何有效作用于病原菌等诸多问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方 法，所得的生防菌发酵液可有效防治苹果腐烂病，对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产 生抗药性、伤口愈合快、病疤复发率低。 本专利技术从山西省苹果产区临汾市苹果园的果树枝干上分离筛选获得2株抑制苹 果树腐烂病菌较好的菌株LF17、LF18,经菌株菌落特征、菌株显微特征及16SrDNA序列分析 鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis)，该菌株保存于山西省农业科学院植物保护研究所菌种 库，枯草芽孢杆菌LF17的保藏号为NO :SAASIPPLF17 ;枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为N0 : SAASIPPLF18 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为： -种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，包括如下步骤： S1、培养基的制备： NA 培养基：称取酵母浸膏 10. 0g，牛肉浸膏 15. 0g，MgS04 · 7H20 0· 5g，FeS04 · 7H20 0· 009g，琼脂粉8. 5g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加 NaOH或HC1调节pH至6. 5,加水 定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121°C高压蒸汽灭菌20min ; NB 培养基：称取酵母浸膏 10. 0g，牛肉浸膏 15. 0g，MgS04 · 7H20 0. 5g，FeS04 · 7H20 0. 009g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加 NaOH或HC1调节pH至6. 5,加水定容至1L，分 装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121°C高压蒸汽灭菌20min ; S2、拮抗菌株的活化： 将菌株LF17、LF18的菌株接种在NA培养基上，25°C恒温培养2d，其中，枯草芽孢 杆菌LF17的保藏号为NO :SAASIPPLF17 ;枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为NO :SAASIPPLF18 ; S3、拮抗菌株的液体培养： 挑取步骤S2中活化的菌株LF17、LF18接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基； 150r · min 恒温振荡培养5d，得到发酵液。 S4、过滤浓缩发酵液： 将步骤S3中制备的发酵液，经滤纸过滤后，浓缩为1. 5倍的原发酵液浓度和3. 0 倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液，4°C条件下保存备用； S5、拮抗菌发酵液田间防治药剂的制备： 将步骤S4所得的1. 5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0. 001g · mL \ 溶液质量为3% -5%的矿物油、溶液质量为2% -3%的吐温80混合搅拌均匀，装瓶备用； S6、拮抗菌发酵液膏剂田间防治药剂的制备： 将步骤S4所得的1. 5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0. 001g · mL \ 溶液质量为3 % -5 %的矿物油、溶液质量为2 % -3 %的吐温80、溶液质量为0. 5 %的黄原胶 混合搅拌均匀制成膏剂，装瓶备用。 上述所得拮抗菌发酵液田间防治药剂的使用方法为： 果树休眠期进行田间防治实验，在苹果树病疤周围延出0. 5cm处用刀割深达木质 部的保护圈，然后将圈内的病皮和健皮彻底刮除，尽量使伤口形状纵长、横窄，且周边圆滑， 刮掉的病组织集中烧毁； 刮除病组织后，在已暴露的木质部涂少量上述配置好的发酵液防治药剂，稍等2-3 分钟，待药剂渗入后，用刀刮除木质部残留的病斑褐变组织，直到褐变组织完全刮完。在刮 好的病斑处涂抹上述配置好的发酵液防治药剂，使药剂完全覆盖病斑病外延1. 5cm，处理后 10天后再涂1次发酵液膏剂（黄原胶）或发酵液（含渗透剂等成分）。 本专利技术具有以下有益效果： 1)、本专利技术枯草芽孢杆菌（B. subtilis)菌株LF17、LF18发酵液对苹果树腐烂病 菌有显著的抑制作用，致使腐烂病菌菌丝颜色明显加深、顶端显著膨大、明显畸形、菌丝粗 细不均匀、有的菌丝分支增多、部分菌丝细胞质外渗。实施例的研究表明，发酵液对苹果树 腐烂病菌的抑制可达到99. 9%，抑菌效果高于化学药剂甲基硫菌（94.2% )、苯醚甲环唑 (81. 3% )。室内苹果离体枝条防治试验中，发酵液对苹果树腐烂病的防效为80. 04%，与化 学药剂苯醚甲环唑、甲基硫菌灵防效相当。 2)、本专利技术将发酵液与青霉素钠按比例混用，提高了发酵液防治药剂的稳定性。 实验研究表明，含有0. 〇〇lg · mL 1青霉素钠 PDA培养基对苹果树腐烂病菌的抑制率达到 78. 6%，在含有0. 001g ·ιΛ 1青霉素钠的发酵液培养基上，对苹果树腐烂病菌的抑制率达到 96 %。本专利技术通过将发酵液与青霉素钠二者混合，提高了发酵液在田间的稳定性、防治效果 显著提高，从71. 76% (发酵液原液）提高至80. 04% (发酵液含青霉素等物质）。 3)、本专利技术将拮抗菌发酵液与青霉素钠按比例混用，同时加入矿物油、吐温等物 质，提高了发酵液的渗透性，使之能有效渗透进入树皮，抑本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防治苹果树腐烂病的生防菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、培养基的制备：NA培养基：称取酵母浸膏10.0g，牛肉浸膏15.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.009g，琼脂粉8.5g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加NaOH或HCl调节pH至6.5，加水定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min；NB培养基：称取酵母浸膏10.0g，牛肉浸膏15.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.009g，葡萄糖30g混合后，用酸度计测，加NaOH或HCl调节pH至6.5，加水定容至1L，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min；S2、拮抗菌株的活化：将菌株LF17、LF18的菌株接种在NA培养基上，25℃恒温培养2d，其中，枯草芽孢杆菌LF17的保藏号为NO：SAASIPPLF17；枯草芽孢杆菌LF18的保藏号为NO：SAASIPPLF18；S3、拮抗菌株的液体培养：挑取步骤S2中活化的菌株LF17、LF18接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基；150r·min‑1，25℃恒温振荡培养5d，得到发酵液。S4、过滤浓缩发酵液：将步骤S3中制备的发酵液，经滤纸过滤后，浓缩为1.5倍的原发酵液浓度和3.0倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液，4℃条件下保存备用；S5、拮抗菌发酵液田间防治药剂的制备：将步骤S4所得的1.5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0.001g·mL‑1、溶液质量为3％‑5％的矿物油、溶液质量为2％‑3％的吐温80混合搅拌均匀，装瓶备用；S6、拮抗菌发酵液膏剂田间防治药剂的制备：将步骤S4所得的1.5倍的原发酵液浓度的浓缩发酵液与青霉素钠0.001g·mL‑1、溶液质量为3％‑5％的矿物油、溶液质量为2％‑3％的吐温80、溶液质量为0.5％的黄原胶混合搅拌均匀制成膏剂，装瓶备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓军，殷辉，周建波，张志斌，姚众，秦楠，
申请(专利权)人：山西省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14
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