本发明专利技术公开了一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90相对表达量的方法。本发明专利技术中周氏啮小蜂Hsp90实时荧光RT-PCR检测方法的建立，为研究周氏啮小蜂Hsp90表达调控机理及其生态防治奠定基础。研究温度的变化对于周氏啮小蜂体内Hsp90基因表达量的影响，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础，这对于以后在何种室外温度下放飞周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。本发明专利技术为在mRNA水平对Hsp90基因的相对定量分析提供了技术平台。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】采用焚光RT-PCR技术检测周氏嗤小蜂Hsp90基因表达的 方法 本专利技术得到：国家自然科学基金（31201730);天津市高等学校科技发展计划项目 (20110602);天津师范大学博士基金（52XB1003)及天津市动植物抗性重点实验室开放基金 的资助。
本专利技术涉及生物
，涉及用于检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的特异性引 物，更具体的说是一种。主要 用于周氏啮小蜂Hsp90基因表达调控机理及其生态防治的研究，研究结果可为科学利用天 敌昆虫周氏啮小蜂进行生物防治提供理论基础。
技术介绍
热激蛋白Heat shock protein (Hsp)是一类在生物体内广泛存在的，对体内外 环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物 研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp90与 温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温 度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使 生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有 显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含 量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。 周氏嗤小蜂CAoi/ioiaciMea Yang是我国重要入侵物种美国白蛾 (Drury)的重要寄生性天敌，体长1. 1-1. 5mm，群集内寄生于美国白蛾蛹 中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国 白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、 寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等 通过野外释放C 可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境下，C ??ea的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C??ea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。 实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧 光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技 术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光 PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已 广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年 来，实时荧光PCR技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达 的方法。 为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下： 设计一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的特异性引物，其特 征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：Hsp90-F :5' -TAACGATGATGAACAATA -3'；Hsp90-R:5'-AATAGGATAGCCAATGAA-3'； 本专利技术所述特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的方法，其特征在于按如 下步骤进行： (1) 使用下述引物进行该基因的检测： 符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物： Hsp90-F :5'-TAACGATGATGAACAATA-3' Hsp90-R:5'-AATAGGATAGCCAATGAA-3， (2) 总RNA的提取：采用各种通用的RNA提取方法，从周氏啮小蜂成体中提取总RNA; (3) cDNA合成：以周氏啮小蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL; (4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA为模板，上述（1)中Hsp90-F和Hsp90-R、GADPH-F 和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所 得3个平行管的Ct值取平均数。 (5)周氏啮小蜂在不同温度下Hsp90基因相对表达量计算： 实时荧光PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用ΛΛCT法计算不同 温度下Hsp90基因相对于内参GADPH基因的mRΝΑ相对表达量。 本专利技术所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25μ mol/L的贮存液， 工作浓度为〇. 5μmol/L。 本专利技术进一步公开了采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的特 异性引在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化方面的应用。实验结果表明：图1为不同 温度下周氏啮小蜂Hsp90基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响 周氏啮小蜂体内的Hsp90的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂 体内的Hsp90的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7°C时达到最大表达量；在高温胁迫的 情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp90的相对表达量也呈上升的趋势，但 在40°C时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白 蛾具有重要意义。 本专利技术提供的特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的方法与现有技 术相比的有益效果是： (1)本专利技术采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动 化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术 全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR 技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。 (2)在通过RT-qPCR的方法研究不同温度下Hsp90基因表达的变化，结果显示在 不同温度条件下周氏啮小蜂体内的Hsp90基因的表达水平处于一个动态过程中，高温和低 温胁迫都使周氏啮小蜂体内Hsp90有一个高的表达量，在40°C和_7°C体内表达量最大。 (3)因此本专利技术提出研究了周氏啮小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子 对自身的伤害的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一 个新的思路和技术。 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp90基因，其cDNA序列和编码氨基酸的序列表1，表，2所 7Jn〇表1 【附图说明】 图1为周氏啮小蜂Hsp90在相同时间不同温度胁迫下表达变化。【具体实施方式】 下面结合实施例说明本专利技术，这里所述实施例的方案，不限制本专利技术，本领域的专 业人员按照本专利技术的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本 专利技术的范围内，本专利技术的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本专利技术中 所述的提取白蛾周氏啮小蜂总RNA的提取，cDNA的合成，实时荧光定量RT-qPCR等方法都 是本领域成熟的技术，试剂盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等 都可以从生产商家购买。 实施例1: 获得白蛾周氏啮小蜂Hsp90基因序列 实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏啮小蜂(培养条件：于人工气候箱（PQX-350H) 中，温度25°C，相对湿度60%~8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用荧光RT‑PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的特异性引物，其特征在于它是由符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物：Hsp90‑F：5'‑TAACGATGATGAACAATA ‑3'; Hsp90‑R：5'‑AATAGGATAGCCAATGAA‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，王凤竹，张新玥，李婷婷，朱耿平，刘强，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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