本发明专利技术公开了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，包括以下步骤：1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品，使微纳结构样品内部发生多重散射；2)通过显微镜对单一空间频率样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微纳光源的频移量；3)更换具有不同单一空间频率的结构样品，建立所述的微纳光源与各空间频率对应的频移数据库；4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对待测样品进行360度的照射，在照射过程中应用显微镜进行成像，得到相应的频移图像；5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超分辨显微图像。本发明专利技术还公开了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方 法与装置。
技术介绍
由阿贝衍射极限理论可知，常规远场光学显微镜的极限分辨率可表示为其中λ为所用照明光的波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，在可见光 波段，光学显微镜的分辨率被限制在200纳米左右。然而，随着生物医学等技术的发展，研 究人员们已经开始对生物组织和细胞在纳米尺度上进行分析，所观察的样品性质也多种多 样，因此需要一种对样品的普适性强的可以突破常规衍射极限的新技术，来实现超分辨显 微。 衍射极限限制分辨率也可以从傅利叶频谱的角度进行分析，即二维物体都是由一 系列角谱按照相应的权重叠加而成的。其中高频分量对应的是物体的细节信息，但由于光 波的波矢有限，无法承载这些高频信息到达远场，而只能以倏逝波的形式在近场存在。所谓 的超分辨即将这些高频信息从近场提取出来。比如SNOM技术，是通过近场探针与样品表面 相互作用来提取近场信息。再比如SIL技术，是通过大折射率固体浸没使光波波矢增加，使 近场更多的高频信息可以从倏逝波的形式变为行波传到远场。但以上技术或者需要昂贵的 设备和复杂的后续处理，或者对应的分辨率相对有限。
技术实现思路
本专利技术从一种全新的角度出发，提出利用微纳照明下的多重散射效应来提取近场 信息。该方法简易、快捷、可靠，通过微纳光源与样品结构相互作用，使样品的频谱发生缩 放，高频变为低频传到远场，在样品表面以下形成一放大的虚像，并得到λ/10以上的分辨 率。在本专利技术的多重散射超分辨显微方法中，包括如何使微纳光源与待分辨结构相互作用、 如何得到所有方向的高频分量、如何对输出结果进行处理。 -种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，包括以下步骤： 1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品（如光栅），使微纳结 构样品内部发生多重散射； 2)通过显微镜对微纳结构样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微 纳光源的频移量； 3)更换不同的具有单一空间频率的微纳结构样品，重复步骤1)和步骤2)中的操 作，利用微纳光源在各空间频率下的频移量建立频移数据库； 4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对出射光的方向进行360度的扫描或对 待测样品进行360度的照射，在扫描或照射过程中应用与步骤2)中相同的显微镜进行成 像，得到相应的频移图像； 5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超 分辨显微图像。 多重散射是指样品中的每一散射点都可以作为发射球面波的子波源，发射的子球 面波相互叠加后重新分布于物体中，之后每一点再作为子波源对新的光场产生散射，如此 循环下去，最终得到稳定存在的散射场。多重散射场会将物体高频信息传达到远场。然而， 一般的光学显微照明方式会引入相当多的噪声，使由多重散射所加载的高频信息完全被淹 没，难以提取。微纳结构由于尺度上与光波长可比拟，它所提供的照明则可以有效地压制噪 声，使多重散射对高频信息的加载和提取变得简单易操作，且具有分辨率高、实时成像、装 置简单、处理方便、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。 在本专利技术中，微纳光源有多种实施方式，在这里我们提供几种优选的实施方式： 优选的，所述的微纳光源为内部定向传输有耦合光的平板波导，其厚度小于1微 米，所述的微纳结构样品和待测样品置于或嵌入所述的平板波导表面。 优选的，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，其直径小于1微米，所述 微纳光纤的出射光用于照亮所述的微纳结构样品和待测样品。 并列优选的，所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，微纳结构样 品和待测样品被纳米线的出射光照亮，或者所述的纳米线环绕样品并沿样品轮廓进行弯 曲。 其中，微纳光纤和平板波导为被动发光的微纳装置，需要将外界光耦合到其中并 保证传播，半导体纳米线可主动发光，需要搭建激发光路使其自发辐射。采用平板波导，微 纳光源与待观察结构相互作用，需使微纳波导表面与待观察结构紧密贴合；若采用微纳光 纤或纳米线，需调整微纳光源的出射方向及其与样品之间的距离，才能使样品内部发生有 效散射。 纳米线作为微纳光源进行观察时，要求纳米线表面形貌良好，直径在1微米以下， 可根据样品对纳米线直径的选择进行适当调整。纳米线的材料可以是单一半导体材料比如 CdS、CdSe、GaN、ZnO,也可以是掺杂、引入缺陷或多元半导体材料。 同时，本专利技术还提供了一种微纳照明下的多重散射超分辨显微装置，包括： 微纳光源，用于使样品内部发生多重散射，抑制噪声； 显微镜，用于对发生多重散射后的样品进行光场成像，得到频移图像； CXD :用于能显微镜成像进行拍照； 计算机，用于对频移图像进行频谱分析，建立频移数据库；以及后续样品图的还原 和重构，得到超分辨显微图像。 优选的，所述的微纳光源为内部定向传输有f禹合光的平板波导，所述样品置于或 嵌入所述的平板波导表面，该平板波导的底部依次设有反射层和波导衬底，也可以选择合 适材料既充当反射层也充当衬底；衬底及其上微纳波导、样品结构放在显微镜的载物台上。 耦合光在可见或近紫外波段，平板波导厚度要在1微米以下，可从几百纳米到几十纳米不 等。厚度变小，分辨率会变高，但同时波导的传导能力会变差，可能会限制到观察的空间范 围。 衬底的选择可以透明也可以不透明，它的作用主要是支撑微纳装置。但在需要为 波导提供反射面且反射层就由衬底本身来充当的情况下，最好选择与波导层折射率差大的 材料作为衬底。 并列优选的，所述的微纳光源为内部通有耦合光的微纳光纤，直径小于1微米，显 微镜的载物台上设有衬底，所述的样品置于或嵌入衬底表面。 微纳光纤作为一种一维微纳结构，方便转移和操纵。微纳光纤通光后，使其端头与 待观察结构靠近，并调整端头和结构之间的距离及光注入的方向，使得光场以尽可能大的 横向分量，尽可能小的场变形注入到结构上，同样在结构内部发生多重散射，叠加后的总光 场传到远场被显微物镜、目镜成像，构成一个位于二维物体表面下方的放大的虚像。由于 通过这种方法引入的倏逝波方向比较纯粹，因此有效地避免了不同空间高频分量之间的串 扰。 当通在光纤里的光频较为单一时，比如激光，那么光场在样品结构上发生多重散 射的过程中会有较为明显的干涉效应，在得到最终的超分辨图像过程中，需要通过图像处 理消除产生的干涉条纹，如果选择通宽波段的光进行照明，则可得到更为清晰干净的图像。 并列优选的，所述的微纳光源为受外界激发产生自发辐射的纳米线，所述显微镜 的显微物镜和显微目镜之间设有半透半反镜，用于照明光与激发光之间的光路切换。 将纳米线通过分子间作用力或更为稳固的粘合工艺使其与可三维移动的精密装 置连接，将显微镜的照明光换成激发波段的光以激发纳米线发生自发辐射，从纳米线端头 出射的宽范围荧光在样品结构上多重散射。这样省去了需要将照明微纳光纤与外界激光耦 合相连的麻烦，使微纳光纤操纵起来更加自由。 以上两种优选方法无需对观察样品进行处理，而只需要灵活地操纵通光或自身发 光的微纳光纤，调整其位置与方向对样品进行扫描，最终便可得到包含各个方向高频信息 的超分辨图像。 进一步优选的，所述的纳米线和样品放置在衬底波导层上，且该纳米线环绕样品 沿本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微纳照明下的多重散射超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用微纳光源作用于具有单一空间频率的微纳结构样品，使微纳结构样品内部发生多重散射；2)通过显微镜对微纳结构样品进行光场成像，并对像进行频谱分析，得到所述微纳光源在该空间频率下的频移量；3)更换具有不同单一空间频率的微纳结构样品，重复步骤1)和步骤2)中的操作，利用微纳光源在各空间频率下的频移量建立频移数据库；4)利用所述的微纳光源观察待测样品，并对待测样品进行360度的照射或扫描，在此过程中应用显微镜进行成像，得到相应的频移图像；5)根据所述的频移数据库，对频移图像进行频谱还原和重构，得到待测样品的超分辨显微图像。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，刘小威，刘旭，李海峰，匡翠方，郝翔，周雅旋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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