经设计的成骨蛋白制造技术

本发明专利技术涉及对关联受体具有改变的亲和性的新型经设计的成骨蛋白、编码该蛋白的核酸序列、以及使用其的方法。更优选地，所述新型经设计的成骨蛋白是经设计的BMP并且对关联BMP受体具有改变的亲和性。所述经设计的BMP显示出改变了的生物学特征并提供了潜在的新的有效疗法。

【技术实现步骤摘要】
经设计的成骨蛋白本申请是2011年8月17日提交的题为“经设计的成骨蛋白”的中国专利申请201180040389.7的分案申请。专利
本申请涉及成骨蛋白(osteogenicprotein)的领域，制备经改善的成骨蛋白的方法，及利用成骨蛋白治疗患者的方法。专利技术背景胱氨酸结细胞因子超家族分成数个亚家族，包括转化生长因子β(TGFβ)蛋白、糖蛋白激素、血小板衍生生长因子样(PDGF样)蛋白、神经生长因子(NGF)、及成神经细胞瘤中的分化筛选选择基因畸变(DAN)家族(例如Cerberus)。其中TGFβ超家族包含大约43个成员，分成三个亚家族，包括：TGFβ、活化素及骨形态发生蛋白/生长分化因子蛋白(BMP/GDF)。TGF-β超家族成员包含典型的胱氨酸结拓扑。也就是说，胱氨酸结是六个半胱氨酸残基的非寻常排列的结果。所述结是由半胱氨酸1-4、半胱氨酸2-5之间的键以及形成环的间插序列所组成，在半胱氨酸3-6之间的双硫键通过该环。这些蛋白质的活性形式是同型二聚体或异二聚体。在各种情况中，单体拓扑是由半胱氨酸结及额外的半胱氨酸稳定，导致额外的链内键及/或介导与另一蛋白单位的二聚化。见Kingsley，1994，GenesDev.8：133-146；Landeretal，2001，Nature409：860-921。BMP/GDF是TGF-β蛋白超家族中为数最多的成员。BMP/GDF超家族包括但不限于BMP2、BMP3(成骨素)、BMP3b(GDF-10)、BMP4(BMP2b)、BMP5、BMP6、BMP7(成骨蛋白-1或OP1)、BMP8(OP2)、BMP8B(OP3)、BMP9(GDF2)、BMP10、BMP11(GDF11)、BMP12(GDF7)、BMP13(GDF6、CDMP2)、BMP15(GDF9)、BMP16、GDF1、GDF3、GDF5(CDMP1、MP52)及GDF8(肌肉抑制素(myostatin))。BMP有时是指成骨蛋白(OP)、生长分化因子(GDF)、或软骨衍生性型态发生蛋白(CDMP)。BMP也存在于其他动物物种。另外，在人族群的不同成员之间可能存在一些BMP序列的等位基因差异。天然表达的BMP是原蛋白质(pro-protein)，其包含长的原结构域、一或多个切割位点及成熟结构域。此原蛋白质接着藉由细胞机制处理以产生二聚体的成熟BMP分子。该原结构域被认为有助于BMP的正确折迭及处理。另外，在一些但非所有的BMP中，该原结构域可能与该成熟结构域非共价结合，且可能作为伴护子，也可能作为抑制子(例如Thicsetal.，GrowthFactors18：251-9(2001))。BMP信号传导是当BMP二聚体与二个I型及二个II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合时被启动。I型受体包括但不限于ALK-1(Activinrcccptor-LikcKinase1(活化素受体样激酶1))、ALK-2(亦称为ActRla或ActRI)、ALK-3(亦称为BMPRIa)及ALK-6(亦称为BMPRIb)。II型受体包括但不限于ActRIIa(亦称为ActRII)、ActRIIb及BMPRII。人基因组包含12个受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，包括7个I型及5个II型受体，所有这些受体皆与TGF-β传讯有关(Manningetal.，Science298：1912-34(2002)，该文献的揭示内容以参照方式纳入本专利技术)。因此，由12个受体及43个超家族成员可知，至少某些TGF-β超家族成员与相同受体结合。在BMP结合之后，该II型受体使该I型受体磷酸化，该I型受体使转录因子的Smad家族的成员磷酸化，且使该Smad转位至细胞核并活化数种基因的表达。BMP是TGF-β超家族中为数最多的成员，他们控制一组广泛的细胞性及发育性过程，诸如胚胎模式形成及组织特异化，亦能促进伤口愈合及成人组织的修复过程。BMP最初是藉由彼等诱导骨及软骨形成的能力而被分离。BMP传讯可在骨折及相关组织伤害时被诱导，以导致骨再生及修复。改变对BMP受体的亲和性的BMP分子将具有相较于该原始蛋白质改善的生物活性。这些BMP包括具有增加活体内活性的蛋白质，且可能提供用于(除其它者外)组织再生、修复、及类似者的潜能改善的治疗剂，其中藉由在较低的蛋白量下提供较高或经改变的活性，以提供改善的蛋白质治疗剂。专利技术概述本专利技术包括一种经设计的骨形态发生蛋白(BMP)，其在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变，其中相较于对应的野生型BMP与该I型或II型受体的结合，该突变赋予经政变的与该I型或II型BMP受体的结合。在一方面中，该蛋白选自BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8或BMP9。在另一方面中，该蛋白在II型结合结构域A、II型结合结构域B、I型结合结构域及上述结构域的任何组合内包含至少一种突变。本专利技术亦提供一种经设计的成骨蛋白，其包含氨基酸序列，该氨基酸序列在至少一个I型或II型受体结合结构域中包含至少一种突变，其中相较于野生型BMP2与该I型或II型受体的结合，该突变赋予经改变的与该I型或II型BMP受体的结合。在一方面中，该突变在II型结合结构域A内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的V33、P36、H39和F41处的突变。在另一方面中，该突变是在II型结合结构域A内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的V33、P36K、P36R、H39A和F41N的突变。在又一方面中，该突变是在II型结合结构域B内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的E83、S85、M89、L92、E94、E96、K97和V99处的突变。在另一其他方面中，该突变是在II型结合结构域B内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的E83K、S85N、M89V、L92F、E94D、E96S、K97N和V99I的突变。在另一方面中，该突变是在I型结合结构域内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80处的突变。在又一方面中，该突变是在I型结合结构域内的突变，其中该突变是至少一种选自对应于SEQIDNO:1序列的H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、于N71后插入P、S72E、K73Y、I74V、A77P和V80A的突变。在另一其他方面中，该蛋白包含对应于SEQIDNO:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80的突变。在另一方面中，该蛋白包含对应于SEQIDNO:1序列的各氨基酸H44、P48、A52、D53、L55、S57、N68、S69、V70、于N71后插入单一氨基酸、S72、K73、I74、A77和V80的突变，其中这些突变是H44D、P48S、A52N、D53A、L55M、S57A、N68H、S69L、V70M、本文档来自技高网...

【技术保护点】
经设计的成骨蛋白，其由SEQ ID NO:71的序列组成。

【技术特征摘要】
2010.08.20 US 61/375,6361.一种组合物，包含：经设计的成骨蛋白，所述经设计的成骨蛋白包含选自SEQIDNO:37和71的序列；以及与经设计的成骨蛋白结合的医药上可接受的载剂。2.权利要求1的组合物，其中所述医药上可接受的载剂包括可吸收的胶原蛋白海绵。3.权利要求1的组合物，其中所述医药上可接受的载剂包括有孔陶瓷颗粒。4.权利要求1的组合物，其中所述经设计的成骨蛋白在溶液中。5.权利要求4的组合物，其中通过用经设计的成骨蛋白的溶液湿润所述医药上可接受的载剂，使所述经设计的成骨蛋白与所述医药上可接受的载剂结合。6.一种试剂盒，用于形...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·P·贝拉斯，C·T·布朗，M·J·凯恩，V·P·卡拉布罗，Z·S·尤奥，R·V·P·马蒂内，H·J·泽赫曼，J·M·沃兹尼，
申请(专利权)人：惠氏有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US