本发明专利技术提供了miRNA mimics用于制备治疗脉络膜新生血管药物的应用。发明专利技术人通过microRNA调节骨髓来源细胞MMP表达，利用骨髓来源细胞向CNV趋化的特性实现在CNV部位的高精准靶向给药与缓释给药，抑制骨髓来源细胞与原位细胞形成病理新生血管。本发明专利技术还提供了microRNA agomir用于制备治疗脉络膜新生血管药物的应用。发明专利技术人通过一种microRNA agomir同时调节BMCS的两种MMP表达，既达到抑制BMCS的侵入进而减少CNV细胞和因子来源，又可抑制原位细胞移行，可高效治疗CNV；此外，由于BMCS仅在CNV局部富集的特性，可实现在CNV部位的高精准靶向治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医疗
，具体涉及microRNA mimics用于制备治疗脉络膜 新生血管药物的应用。
技术介绍
脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV)是40余种眼部疾病的 共有病变，发病率高，严重威胁视功能。CNV病因复杂，发病机制尚不明确。目前临床上针 对CNV虽有多种治疗方法，但存在着疗效不佳、复发率高、长期安全性不确切和价格昂贵等 问题，给家庭及社会带来沉重的负担，该领域研究已成为国家重大的战略需求。探索CNV发 病机制、积极寻找高效靶点抑制新生血管生成，是从根本上治愈CNV相关疾病的希望所在。 由于新生血管的形成是多种细胞、分子共同作用的结果，细胞、分子间的相互作用又错综复 杂，针对单一细胞/因子开发的药物防治效果往往有限。积极寻找调控新生血管生成机制 中的关键节点，对于CNV的防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了 。 所述的 microRNA mimics 为 miR188_5p 模拟物。 本专利技术还提供了 microRNA agomir用于制备治疗脉络膜新生血管药物的应用。 所述的microRNA agomir为经甲基化修饰的miR188_5p模拟物。 本专利技术的有益效果是： 新生血管生长是一个较为长期的过程，采用新生血管抑制因子治疗CNV需要寻找 更为有效的方式。在CNV的发生发展过程中，骨髓来源细胞可以特异性趋化至CNV处，参与 病理性新生血管形成，是CNV的重要组成成分。专利技术人通过microRNA调节骨髓来源细胞 MMP表达，利用骨髓来源细胞向CNV趋化的特性通过常规静脉输入实现骨髓来源细胞在CNV 部位的高精准靶向给药与缓释给药，抑制病理新生血管形成，实现有效治疗CNV的目的，并 避免反复眼内注射给药的风险。 专利技术人发现，CNV生成时BMCS侵入和原位细胞移行所必需的MMP2/13的主要来 源就是BMCS，而BMCS内miR-188-5p可同时调控MMP2/13的表达。专利技术人利用人工合成的 microRNA模拟物agomir调节BMCS内miR-188_5p水平，通过常规玻璃体腔注射miR-188_5p agomir实现单一药物产生的级联效应对多重祀点的干预，即同时减少MMP2/13分泌，一方 面抑制BMCs向CNV区域侵入，从而减少CNV的细胞和因子来源，另一方面抑制原位细胞移 行，减少血管管腔形成，多靶点治疗CNV，抑制病理新生血管形成，达到高效治疗CNV的目 的，在CNV早期即可显著抑制其生长，缩短治疗时间，避免长期反复给药的风险。此外，由于 BMCS仅在CNV局部特异性富集的特性，玻璃体内给药仅在CNV处产生效应，达到靶向治疗。【附图说明】 图1为组织ELISA检测不同时间点MMP-2/MMP-13蛋白表达；A、激光诱发CNV后 MMP-2的表达；B、激光诱发CNV后MMP-13的表达； 图2为实时定量PCR检测miR188-5p的表达； 图3为激光共聚焦显微镜下观察，GFP+的BMCs为绿色，MMP-2/MMP-13/miR188-5 为红色，两者共表达区域（箭头）为黄色；A、激光诱发CNV后3天共定位MMP-2与GFP+的 BMCs ;B、激光诱发CNV后7天共定位MMP-2与GFP+的BMCs ;C、激光诱发CNV后7天共定位 MMP-13与GFP+的BMCs ;D、激光诱发CNV后28天共定位MMP-13与GFP+的BMCs ;E、激光诱 发CNV后1天共定位miR188-5p与GFP+的BMCs ;F、激光诱发CNV后7天共定位miR188-5p 与 GFP+ 的 BMCs ; 图4为统计分析各时间点BMCs内MMP-2/MMP-13/miR188-5p的表达构成比；A、激 光诱发CNV后各时间点中MMP-2的总表达量及其中BMCs的表达构成比；B、激光诱发CNV后 各时间点中MMP-13的总表达量及其中BMCs的表达构成比；C、激光诱发CNV后各时间点中 miR188-5p的总表达量及其中BMCs的表达构成比； 图5为激光诱发CNV后各时间点中BMCs表达的MMP-2、MMP-13和miR188-5p在各 个时间点的免疫荧光面积统计。 图6为给药后CNV区域各时间点中BMCs表达的miR188-5p和MMP-2/MMP-13 ; 图6A、冰冻切片荧光原位杂交代表图。红色：miR-188-5p ;绿色：GFP+BMCs ;上：NC组；下： agomir组；图6B、冰冻切片免疫荧光代表图。红色：MMP-2/MMP-13 ;绿色：GFP+BMCs。 图7为给药后动态观察CNV严重程度以及BMCS募集情况。图7A、脉络膜铺片荧光 染色后共聚焦拍摄CNV的3D成像代表图及CNV体积统计分析。红色：新生血管；图7B、脉 络膜铺片后荧光显微镜拍摄CNV代表图。红色：新生血管；绿色：GFP+BMCs ;左：NC组；右： agomir 组。 图8为MMP-2和MMP-13信使RNA的3'非编码区有miR188-5p的互补结合位点。【具体实施方式】 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs)在CNV生成过程中降解细 胞外基质和内源性血管抑制因子，促进细胞的移行和新生血管出芽、管腔形成，同时有利于 骨髓来源细胞（bone marrow derived cells, BMCs)侵入CNV内，参与新生血管形成。CNV 原位细胞表达的MMPs是有限的，BMCs参与CNV生成，是CNV中MMPs的重要来源。专利技术人研 究发现，miR188-5p对MMP-2/-13的表达起调控作用。本研究通过构建嵌合体小鼠的CNV模 型，观察探讨参与CNV生成的BMCs是否是MMPs的重要来源及BMCs表达的MMP-2/-13是否 受miR188-5p调控进而影响CNV发展。进一步的，利用人工合成的microRNA模拟物agomir 调节BMCs内miR-188-5p水平，抑制MMP2/13分泌，从而抑制BMCs的侵入和原位细胞移行， 达到高效、靶向治疗CNV作用。 关于microRNA调控BMCs表达MMPs影响CNV发生发展及相应治疗策略的实验研 究 1材料与方法 1. 1试剂和仪器 兔抗小鼠 MMP-2/MMP-13多克隆抗体（美国Abeam公司）；DyLight 594标记的羊抗 兔抗体（美国Earth公司）；生物素标记的山羊抗兔抗体（美国Neomarkers公司）；MMP-2 组织ELISA试剂盒（美国Abeam公司）；MMP-13组织ELISA试剂盒（武汉博士德生物制品 有限公司）；mir-188-5p原位杂交试剂盒（武汉博士德生物制品有限公司）；实时定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa公司） 1. 2动物来源 采用绿色焚光蛋白（green fluorescent protein，GFP)雌性转基因小鼠作为骨 髓移植的供体，6~8周龄，体重18~24g，由第四军医大学神经生物学教研室提供；受体 鼠为野生型雌性C57BL/6J小鼠，6~8周龄，体重18~24g，由第四军医大学实验动物中心 提供，接受骨髓移植的50只C57BL/6J. GFP嵌合体小鼠为实验组，未作移植的48只野生型本文档来自技高网...
【技术保护点】
microRNA mimics用于制备治疗脉络膜新生血管药物的应用。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯慧媛，高凡，梁宏亮，王雨生，吕洋，王海燕，郭长梅，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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