一种提高豆粨降解效率的方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种提高豆粨降解效率的方法，有效的提供豆粨的酶解效率。为了提高碱性蛋白酶对豆粨的降解效率，提供一种能高效降解豆粨为多肽的碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其一种编码基因的序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术使用优化后的碱性蛋白酶来制备重组枯草芽孢杆菌，从而再更短的时间内对豆粨发酵完全，从而有效的提高了发酵效率，节省了成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种提高豆栢降解效率的方法。
技术介绍
豆柏是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是棉籽柏、花生柏、菜籽柏等动植物油 柏饲料产品中产量最大，用途最广的一种。作为一种高蛋白质，豆柏是制作牲畜与家禽饲料 的主要原料，大约85%的豆柏被用于家禽、水产养殖动物的饲料。 但消化酶系统尚未发育完全的幼畜（特别是对于早期断奶的动物）会对豆栢中 存在的抗营养因子产生过敏反应，对以豆栢作为植物蛋白来源的饲料消化能力较弱。而营 养拮抗因子的存在也是影响大豆蛋白源在饲料中使用的主要因素。而大豆肽中富含许多 小肽，能直接被动物吸收，而且大豆肽抗原性较低，幼畜使用后发生过敏反应的概率大大降 低。研究表明在早期断奶子猪饲料中添加大豆肽作为血浆蛋白粉的替代品，其日均增质量 率、饵料系数、特定生长率等无显着性差异。但目前使豆柏降解为易吸收的小肽的过程中还 存在水解效率较低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高豆栢降解效率的方法，有效的提供豆栢的酶解效 率。 为了提高碱性蛋白酶对豆栢的降解效率（以水解度作为评价标准），申请人对碱 性蛋白酶的序列进行改造，获得了能高效降解豆栢为多肽的碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶的 氨基酸序列为SEQ ID N0:4,其一种编码基因的序列为SEQ ID N0:3。 本专利技术还提供一种重组的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，是将携带有上述 编码基因的重组质粒转化后制备的； 另一方面，申请人用该重组的枯草芽孢杆菌来发酵豆栢。 本专利技术使用优化后的碱性蛋白酶来制备重组枯草芽孢杆菌，从而再更短的时间内 对豆栢发酵完全，从而有效的提高了发酵效率，节省了成本。【具体实施方式】 本专利技术所述的蛋白水解度（Degreeofhydrolysis, DH)是指蛋白质中的肽键被水 解的百分数，其计算公式如下： DH%= h/htotx100 % h是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的妝键的晕摩尔数（mmlo/g蛋白质）、 htat，以酪蛋白为标准，其值为8. 2mmlo/g蛋白质； 当蛋白质的肽键全部被水解生成游离的氨基酸时，则水解度为100% ;没有被水解 时，其水解度为0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就新生成一个_NH2和一个-C00H基， 因此，在测定蛋白质的水解度时，只要定量的测定新生成的的_順2和-C00H基量就可以计 算h值；这样就可以算出蛋白质的水解度来。 本专利技术采用甲醛固定法来测定h值（中华人民共和国国家标准甲醛值法 GB12143. 2-89)〇 下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。 实施例1碱性蛋白酶的优化 1、利用易错PCR的技术在体外向核苷酸序列为SEQIDNO: 1的碱性蛋白酶基因 (编码的成熟肽氨基酸序列为SEQIDN0:2)中引入核苷酸突变，易错PCR的体系如下： 10XPCR Buffer (不含 MgCI2)5yL，dCTP(25mmol/L)2yL，d!TP(25mmol/L)2yL， dGTP(10mmol/L) 1 y L, dATP (lOmmol/L) 1 y L, F (lOpmol/y L) 1 y L, R (lOpmol/y L) 1 yL, Mg2+ (20mM) 14 y L，Mn2+ (3mM) 1. 5 y L，pQC670. 5 y L，Taq DNA polymerase (2. 5U) 1 y L，ddH20 20 y L〇 ：5r -tagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaat-3' 下游引物：5' -atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta-3'； 扩增条件为：94°C lOmin ;94°C 60s，58°C 60s，72°C 2min，30 个循环；72°C 10min。 利用Gel Extraction Kit回收突变体PCR扩增产物。 2、扩增得到的突变产物与表达载体连接 以PQC67质粒为模板，利用 上游引物：tgcagaagcggcaacacgctaaattaagcatgcaagctagttgc 和下游引物 atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta 作为引物进行 PCR扩增，获得载体基因序列。扩增条件为：98°C lOmin ;98°C 10s，55°C 20s，72°C 3min，30 个循环；72°C lOmin。利用Gel Extraction Kit回收PCR扩增产物。 将回收的突变体PCR扩增产物和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体 系如下：5XPhusionHFBuffer10iiL，2.5mMdNTPs8tiL，Insertgene(aprE片段）4uL， Linearizedvector(pQC67)6iiL，PhusionDNAPolymeraselyL，ddH20 21yL。扩增条件 为98。(：1〇1^11;98。(：1〇8,721€3111111，20个循环 ；98。(：1〇8,721€6111111，15个循环；72。(：1〇111111。 将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，得到阳性转化子，即为能表达碱 性蛋白酶突变体的重组菌株（实验菌株）。同时以序列为SEQ ID N0:2的碱性蛋白酶基因 (野生型）构建后作为对照菌株。 3、碱性蛋白酶突变体的筛选无菌条件下将步骤2中获得的重组菌株分别接种于加入50mL培养基试管中（种 子培养基的组成为〇. 5 %的酵母粉，1 %胰蛋白胨，1 %葡萄糖，1. 8 % K2HP04，麦芽糊精5~ 10 %，柠檬酸钠 〇? 1 ~〇? 5 %，CaCl20.1 ~0? 5 %，MgS040. 1 ~0? 5 %，K2HP040.5 ~2 % ) 中，34°(：、210印111振荡培养811;然后再加入3〇1111浓度为12%的大豆分离蛋白容易（5?1溶 液），于34°C、250rpm振荡培养36h ;然后进行离心，获得的上清液测定水解度值DH，从而筛 选出对大豆蛋白粉降解能力增强的重组菌株。最终筛选出2个对大豆蛋白粉降解能力明 显增强的重组菌株（相比于对照株，），命名为8 &以111^-&和8&(^111^-13，其中重组菌株 Bacillus-a的DH值为12、重组菌株Bacillus-b的DH值为17,而对照菌株的DH值为8。 但绝大部分的重组菌株与对照菌株的水解度没有差别，且有的重组菌株的DH值比对照菌 株降低；重复实验的结果也相同。 实施例2筛选出的菌株中碱性蛋白酶序列的确定 利用质粒提取试剂盒分别提取Bacillus - a和Bacillus - b菌株中的质粒；由上 海生工公司对上述质粒分别进行基因测序。测序结果显示：Bacillus - a菌株中的质粒携 带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:3,其编码的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碱性蛋白酶，其特征在于，所述的碱性蛋白酶包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:4的碱性蛋白酶；2)与1)的碱性蛋白酶具有95％或以上同源性，且具有碱性蛋白酶活性的蛋白酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙翠言，张培，类延乐，
申请(专利权)人：孙翠言，
类型：发明
国别省市：山东;37