一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用。本发明专利技术的方法包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米单倍体幼胚，得到玉米单倍体幼胚，所述玉米单倍体诱导系含有A1A2C1C2R1-nj标记。通过实验证明：本发明专利技术的方法可在玉米幼胚时期实现单倍体的鉴别，并且准确率高，挑选速度快，比常规籽粒成熟时期单倍体挑选提前30-35天，解决了单倍体鉴别耗时长的问题，丰富了单倍体鉴别的方法，缩短育种时间，使单倍体育种技术的大规模应用途径更加多样化，加速单倍体育种工程化进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
玉米是一种利用杂种优势的模式作物，玉米育种过程中最为关键的环节是纯系选 育。常规玉米自交系的选育需要经过多代的自交选择，因此选育一个品种往往需要数年的 时间；而且理论上讲，即使自交n(n〇c)代，基因型也不能达到100%的完全纯合状态。利 用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体并进行人工加倍，只需两代就可以得到100%纯合的自 交系，与常规方法相比不仅大大缩短育种进程，而且节约大量的人力、物力和财力。 单倍体育种的首要步骤是单倍体的鉴别，因此单倍体鉴别技术在玉米单倍体育种 中具有很重要的地位。目前，国内外对玉米单倍体的鉴别进行了大量的研究，主要从单倍 体植株形态学水平以及成熟籽粒性状对单倍体进行鉴别，另外也有通过观察籽粒染色体数 目、DNA含量、分子标记等细胞生物学及分子生物学水平进行单倍体鉴别。对玉米单倍体的 形态学进行鉴别研究，主要基于Rl-nj基因的遗传标记法，基于Rl-nj基因的遗传标记法是 目前应用最为广泛的鉴定方法。该方法主要利用了AlA2ClC2BPlRl-nj显性遗传标记系统。 在Al、A2或C2基因的存在下，Rl-nj基因导致胚乳糊粉层和胚中盾片附着紫色。Nanda和 Chase(1966)首次利用了该颜色标记系统去鉴别单倍体，用含有Rl-nj基因的玉米单倍体 诱导系授粉，在诱导系授粉杂交的果穗中，杂合二倍体由于Rl-nj基因在胚和胚乳中同时 表达而表现为胚和胚乳糊粉层均为紫色，单倍体由于孤雌生殖表现为胚乳糊粉层为紫色， 胚为无色。通过观察玉米成熟籽粒胚和胚乳颜色情况，即可将单倍体挑选出来。根据单倍 体植株形态学鉴别单倍体目前广泛采用的方法是利用B1和P11基因可以在植株茎杆表达 的特点，将AlA2ClC2Rl-nj标记系统下挑选的拟单倍体种植于田间，在幼苗期植株表现为 紫色的确定为杂株，植株表现为绿色的确定为单倍体，但是B1和P11这些基因也会受到环 境因素诸如光照和温度的影响而影响鉴定的准确性（Chaikam和Prasanna, 2012)。目前选 育的单倍体诱导系均含有AlA2ClC2Rl-nj遗传标记，有些诱导系还含有B1和P11基因。 通过Rl-nj基因在成熟籽粒的表达情况或者田间植株形态等单倍体鉴别方式周 期长，工作量大，浪费大量人力、物力、财力。从分子水平鉴别单倍体，过程繁杂，价格昂贵， 不适合高通量鉴别，因而不能广泛应用到生产实践当中去。因此探索一种高效的玉米单倍 体鉴别方法对玉米育种同样具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是单倍体育种过程中单倍体鉴别工作量大、准确率低和 鉴别时期晚的问题。 为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种玉米单倍体幼胚的鉴别方法。 本专利技术提供的玉米单倍体幼胚的鉴别方法包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作 为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培 养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚，得到玉米单倍体幼胚； 所述玉米单倍体诱导系含有AlA2ClC2Rl-nj标记。 上述方法中，所述培养的条件为光照培养48h;所述光照的强度为250001X;所述 光照的周期为24h/天。 上述方法中，所述剥胚为取长为2. 0-4. 0mm的玉米幼胚的幼穗进行剥胚。 上述方法中，所述培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质在所述培养基中的浓度： MS盐 3. 0-4. 5g/L、蔗糖 30-60g/L、琼脂 7. 5g/L。 上述方法中，所述培养基的pH为7-9。 上述方法中，所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0g/L、蔗糖40g/L、琼脂 7. 5g/L〇 上述方法中，所述培养基的pH为7。 上述方法中，所述培养的温度为26_30°C;所述培养的湿度为60%。 上述方法中，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚为选取玉米幼胚盾片部 位无色的幼胚，得到玉米单倍体幼胚。 上述方法中，所述玉米单倍体诱导系为农大高诱1号、农大高诱2号、农大高诱3 号、农大高诱4号、农大高诱5号或农大高油高诱3号。 上述方法中，所述母本为郑单958、先玉335、郑58或Mo17。 上述方法在培育玉米单倍体植株中的应用也属于本专利技术的保护范围。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种培育玉米单倍体植株的方法。 本专利技术提供的培育玉米单倍体植株的方法包括如下步骤，将上述方法得到的单倍 体幼胚再生培养，得到植株，根据株型和/或茎杆颜色选取玉米单倍体植株。 上述方法中，所述根据株型和/或茎杆颜色选取玉米单倍体植株的方法为：当玉 米单倍体诱导系植株颜色为紫色时，根据植株茎杆颜色选取玉米单倍体植株：紫色为杂合 二倍体植株，而无色为单倍体植株；当玉米单倍体诱导系植株颜色为无色时，根据植株株型 选取玉米单倍体植株：植株高大或叶片披散为杂合二倍体植株，而植株矮小或叶片上冲为 单倍体植株。 上述方法中，所述诱导系植株颜色为紫色的诱导系为CAUH0I、CAU2、CAU3或CAU4; 所述诱导系植株颜色为无色的诱导系为CAU5或CH0I3。 上述方法中，所述再生培养的培养基的制备方法：每升再生培养基中含有MS盐 1. 5g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至7,倒入三角瓶中，加7. 5g琼脂。 通过实验证明：本专利技术的鉴别单倍体幼胚的方法可在玉米幼胚时期实现单倍体的 鉴别，并且准确率高，挑选速度快，比常规籽粒成熟时期单倍体挑选提前30-35天，解决了 单倍体鉴别耗时长的问题，丰富了单倍体鉴别的方法，缩短育种时间，使单倍体育种技术的 大规模应用途径更加多样化，加速单倍体育种工程化进程。【附图说明】 图1为连续培养48h幼胚显色情况。 图2为培养时间过长，幼胚生根发芽。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 玉米（ZeamaysL.)杂交种郑单958和先玉335为下述实施例中的母本，是北京 德农种业有限公司的产品。 郑58和M〇17均为优良自交系，均在文献"董昕（2014);玉米单倍体诱导基因 qhirl精细定位与新型诱导系选育研究，博士论文"中公开过，公众可从中国农业大学获得。 玉米单倍体诱导系农大高诱1号（CAUH0I)、玉米单倍体诱导系农大高诱2 号（CAU2)、玉米单倍体诱导系农大高诱3号（CAU3)、玉米单倍体诱导系农大高诱4号 (CAU4)和玉米单倍体诱导系农大高诱5号（CAU5)均为下述实施例中的父本，均含有 AlA2ClC2Rl_nj标记，均在文献"Dong,X.，etal. (2014). "Marker-assistedselection andevaluationofhighoilinvivohaploidinducersinmaize.''Molecular Breeding34(3) : 1147-1158. "中公开过，公众可从中国农业大学获得。 玉米单倍体诱导系农大高油高诱3号（CH0I3)为下述实施例中的父本，含有 AlA2ClC2Rl-nj标记，在文献"董昕，2014,玉米单倍体诱导基因qhirl精细定位与新型诱导 系选育研究"中公开过，公众可从中国农业大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米单倍体幼胚的鉴别方法，包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚，得到玉米单倍体幼胚；所述玉米单倍体诱导系含有A1A2C1C2R1‑nj标记。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍江，陈琛，钟裕，陈宝建，王乐乐，李伟，田小龙，刘晨旭，刘金，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11