本发明专利技术公开一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法，是采用高效液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定健康人、糖尿病患者但未患认知功能障碍及糖尿病患者但患有认知功能障碍三组血浆，利用软件对所分离得到的物质分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析，确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定，选择显著的差异性代谢产物构成分析预测糖尿病认知功能障碍平台。可以及时根据糖尿病患者的血浆分析预测糖尿病认知功能障碍，及早发现及早治疗，可降低糖尿病认知功能障碍的发病率，避免由糖尿病认知功能障碍引起的一系列家庭与社会问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分析预测平台的建立方法，尤其是一种基于代谢组学数据建立分 析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。
技术介绍
糖尿病认知功能障碍作为糖尿病的常见并发症，主要症状以学习能力下降、 记忆损害为主，严重可发展为痴呆。虽然并不是糖尿病中最严重的并发症，但由此病引 起的后果是非常严重的，譬如糖尿病患者忘记吃药，将会加重病情等。糖尿病患者患上 认知功能障碍的几率比正常人高50%，II型糖尿病中年患者患痴呆的长期风险显著提 高；65岁以上的老年人12~25%都患有糖尿病，世界范围内10到15个痴呆患者就有1 个是由II型糖尿病引起，如果把糖尿病前期也纳入考虑，大约可达到疒10个患者中就 有1个。目前，临床上采用MoCA和丽SE方法来评价糖尿病认知功能障碍，缺乏血液 学证据。 高效液相色谱作为一种分离设备的联用技术被广泛的使用，其中以高效液相色谱 质谱联用最为常见。高效液相色谱-质谱联用技术始于20世纪70年代，其分析的物质多 数直接进样在HPLC上得到分离，然后在MS上获得准确的定性和定量，从而大大地缩短了 分析时间，提高了分析的灵敏度和准确性。 但是，迄今为止还没有关于以高效液相色谱-质谱联用技术分析血浆内源性成分 并获得代谢组学数据，从而建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种基于代谢组学数据建 立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法。 本专利技术的技术解决方案是：一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能 障碍平台的方法，其特征在于按照如下步骤进行： a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未 患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；将三组血浆样本均置于室温 下解冻15min，涡漩震荡5s ;分别取每个样本100 ill加入300 ill HPLC级甲醇，涡漩震荡 30s，4° C静置20min;对所有样本进行冷冻离心，12000rpm，4° C，15min，取每个样本的上 清液； b. 将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离； 色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱，分离条件为：柱温为40°C ;流速0. 4 ml/min ;流 动相组成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸；梯度洗脱程序见表1 ;进样量为5 yl，自动 进样器温度4°C ; 表1质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V 型； 正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度KKTC;脱溶剂气温度 350°C、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V;离子扫描时间0.03 s、扫描 时间间隔0.02 s、数据采集范围：5(T100 0 m/z ;应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子 模式下产生+离子556. 2771 Da ; c. 数据处理： 对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用 xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱 碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造 成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰 强度； d. 数据分析： 将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11. 〇的Simca-P软 件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析； e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定： 采用PLS-DA模型第一主成分的VIP值，并结合学生氏t检验的p值确定差异性代谢产 物并对其结构进行鉴定； f. 分析预测平台的建立： 选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤： f. 1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排 列，P值升序排列，形成四个列表； f. 2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成 预测平台。 本专利技术是采用高效液相色谱-质谱联用技术分离并鉴定健康人、糖尿病患者但未 患认知功能障碍及糖尿病患者但患有认知功能障碍三组血浆，利用软件对所分离得到的物 质分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析，确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴 定，选择显著的差异性代谢产物构成分析预测糖尿病认知功能障碍平台。可以及时根据糖 尿病患者的血浆分析预测糖尿病认知功能障碍，及早发现及早治疗，可降低糖尿病认知功 能障碍的发病率，避免糖尿病认知功能障碍进一步恶化及带来的严重后果。【附图说明】 图1是本专利技术实施例1主成分分析PCA得分图。 图2是本专利技术实施例1采用PLS-DA对AB两组样本分析得分图。 图3是本专利技术实施例1采用PLS-DA对AC两组样本分析得分图。 图4是本专利技术实施例1采用PLS-DA对BC两组样本分析得分图。【具体实施方式】 按照如下步骤进行： a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未 患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；每组取24个样本，将三组血浆 样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s ;分别取每个样本100 ill加入300 ill HPLC级 甲醇，涡漩震荡30s，4° C静置20min ;对所有样本进行冷冻离心，12000rpm，4° C，15min， 取每个样本的上清液； b. 将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离； LC/MS仪器分析平台为Agilent, 1290InfinityLC, 6530UHDandAccurate-Mass Q-TOF/MS。 色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent, 100 mmX2. 1臟，1.811111)，分离 条件为：柱温为40°C ;流速0. 4 ml/min ;流动相组成A :水+0. 1%甲酸，B :乙腈+0. 1%甲酸； 梯度洗脱程序见表1 ;进样量为5 yl，自动进样器温度4°C ; 表1质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气;飞行管检测模式V型； 正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度KKTC;脱溶剂气温度 350°C、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V;离子扫描时间0.03 s、扫描 时间间隔0.02 s、数据采集范围：5(T100 0 m/z ;应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子 模式下产生+离子556. 2771 Da ; c. 数据处理： 通过安捷伦工作站MassHunter (Version B 03. 01)对所有原始质谱数据进行预处理 并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于代谢组学数据建立分析预测糖尿病认知功能障碍平台的方法，其特征在于按照如下步骤进行：a. 取冷冻储存的三组血浆样本，分别为A组健康人；B组糖尿病患者但未患认知功能障碍；C组糖尿病患者但患有认知功能障碍；将三组血浆样本均置于室温下解冻15min，涡漩震荡5s；分别取每个样本100μl加入300μl HPLC级甲醇，涡漩震荡30s，4°C静置20min；对所有样本进行冷冻离心，12000rpm, 4°C，15min，取每个样本的上清液；b．将每个样本的上清液分别进入LC/MS进行分离；色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱，分离条件为：柱温为40℃；流速0.4 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表1；进样量为5μl，自动进样器温度4℃；表1Time (min)Flow rate (ml/min)A (%)B (%)00.498220.4982170.4595190.4595质谱条件：采用ESI正离子模式进行检测，以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型；正离子模式条件：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4 V；离子扫描时间0.03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围：50~1000 m/z；应用亮氨酸‑脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生[M+H]+离子556.2771 Da；c.数据处理：对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据；具体步骤是在R软件平台下采用xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强度d. 数据分析：将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入版本11.0的Simca‑P软件，分别进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析；e. 差异性代谢产物确定及其结构鉴定：采用 PLS‑DA模型第一主成分的VIP值，并结合学生氏t检验的p值确定差异性代谢产物并对其结构进行鉴定；f. 分析预测平台的建立：选择显著的差异性代谢产物构成预测平台，具体步骤：f.1分别按照差异性代谢产物的VIP值、ROC曲线下的面积和倍数变化的绝对值降序排列，P值升序排列，形成四个列表；f.2挑选所有列表中的前20%的变量为分析预测糖尿病认知功能障碍的标准值，构成预测平台。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：战丽彬，张琳，隋华，梁丽娜，路晓光，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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