本发明专利技术涉及一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物及其应用，所述套式引物包括一对外引物EMISF/EMISR和一对内引物EMISnF/EMISnR，具体序列如下：EMISF：GCGGTAATTCCAACTCCAAG；EMISR：TAAGCAGCACAATCCACTCC；EMISnF：AGTAGCGGAACGGATAGGGA；EMISnR：ACCCAGCATTGTCGGCATAG。本发明专利技术检测灵敏度很高且特异性好，适合含量极低和组织量很小的虾苗中虾肝肠胞虫的监测，适用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫微量感染或潜伏感染的早期监测和预警，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于养殖对虾疾病防治领域，特别涉及一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫 感染早期预警的套式引物及其应用。
技术介绍
近几年对我国养殖对虾疾病的跟踪研宄和流行病学调查发现，一种近几年才开始 在南亚地区流行的对奸微孢子虫--奸肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei)在我国 养殖凡纳滨对虾中亦广泛流行。病理等分析表明，从各地采集的具有发病症状（白便综合 征）的对虾体内检测到大量的、处于不同发育时期的虾肝肠胞虫。感染对虾肝胰腺细胞内 充满微孢子虫孢子，细胞严重空泡化直至碎解，感染虾生长缓慢、免疫力下降，容易感染病 毒、弧菌等其他病原而暴发病毒性或细菌性疾病，经济损失较为严重。由于微孢子虫是细胞 内寄生生物，而且具有坚硬的几丁质外壳，因此，微孢子虫的治疗方法只在家蚕微孢子虫等 几个种类有治疗性药物，且效果欠佳，而对于水产动物微孢子虫尤其是虾肝肠胞虫这种新 发种类，目前还没有治疗措施的相关报道。对虾感染虾肝肠胞虫后难以消除，常常终身携 带。因此，目前对于虾肝肠胞虫的控制应该以防为主，尽量在感染早期/潜伏期及早发现虾 肝肠胞虫的感染，实现早期预警，有效控制病原的感染与传播，避免虾肝肠胞虫病及继发性 病毒病、细菌病的大规模流行和暴发。 虾肝肠胞虫的传播方式是垂直传播和水平传播共存。如果种虾感染虾肝肠胞虫， 则可以通过垂直传播传给子代虾苗，由于虾苗的培育密度和温度很高，非常利于微孢子虫 的增殖和水平传播，从而使感染虾肝肠胞虫的虾苗数量迅速增多，因此，种虾和虾苗虾肝肠 胞虫感染的早期预警比养殖时期更为重要。分子PCR诊断技术由于快速、简便、样品组织需 要量小，因而，适于对虾中虾肝肠胞虫尤其是种虾和虾苗中虾肝肠胞虫的快速诊断，但是， 我国国内还未见到关于虾肝肠胞虫的正式报道，也没有关于我国虾肝肠胞虫流行种的分子 检测技术，迫切需要设计针对我国流行种的高度特异而灵敏的引物，为我国养殖对虾虾肝 肠胞虫的及早预警和及时预防提供技术保障。 由于微孢子虫是细胞内寄生生物，还具有坚硬的几丁质外壳，不仅影响DNA的提 取效率，而且容易出现较短的片段，因此，国内外基于通用引物（扩增长片段）的微孢子虫 的普通PCR检出率比细菌、病毒等病原的检出率要低许多，定量PCR技术虽然灵敏度有一定 提高，但是检测成本大幅提高，而且对仪器要求较高。套式PCR技术通过设计内、外两对嵌 套引物进行两轮扩增，痕量的模板DNA被富集、扩增到可以检测的量，放大效率极高，且因 为两对引物扩增的目的基因是嵌套的，扩增的特异性大大增强，达到高灵敏度、高特异性扩 增目的基因的目的。该法与单对引物的普通PCR相比效率高出很多，与荧光定量PCR相比 又相对简单易行且成本低廉。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期 预警的套式引物及其应用，该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，适合含量极低和组织 量很小的虾苗中虾肝肠胞虫的监测，适用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫微量感染或潜伏感染 的早期监测和预警，具有良好的应用前景。 本专利技术的一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物，所述套式 引物包括一对外引物EMISF/EMISR和一对内引物EMISnF/EMISnR，具体序列如下： EMISF ：GCGGTAATTCCAACTCCAAG ； EMISR ：TAAGCAGCACAATCCACTCC ； EMISnF ：AGTAGCGGAACGGATAGGGA ； EMISnR :ACCCAGCATTGTCGGCATAG。 所述外引物EMISF/EMISR的扩增片段长度为423bp。 所述内引物EMISnF/EMISnR的扩增片段长度为188bp。 本专利技术的一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物的应用，所 述套式引物应用于我国对虾虾肝肠胞虫的分子检测和疾病预警。 本专利技术基于通用引物的广泛的流行病学调查以及普通和超微病理分析表明，感染 我国凡纳滨对虾的虾肝肠胞虫为同一个种，SSU rRNA基因序列相同。据此，设计了一套基 于我国对虾虾肝肠胞虫种的基因序列的，且扩增片段很短的套式引物。 有益效果 本专利技术检测灵敏度很高且特异性好，适合含量极低和组织量很小的虾苗中虾肝肠 胞虫的监测，适用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫微量感染或潜伏感染的早期监测和预警，具 有良好的应用前景。【附图说明】 图1为8尾凡纳滨对虾虾苗肝胰腺组织DNA的引物扩增结果；其中，前8个泳道为 套式引物扩增结果，后8个泳道为外引物扩增结果。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 实施例1 分别应用 EMISF/EMISR 引物和套式引物（EMISF/EMISR 和 EMISnF/EMISnR)对 4 个 虾池来源的虾苗样品肝胰腺组织DNA模板进行PCR扩增试验。 外引物（EMISF/EMISR)扩增体系和条件：扩增体系共25 μ L，由1 μ L组 织DNA模板、0. 5 yL正向外引物EMISF (10 μ M)、0. 5 yL反向外引物EMISR (10 μ Μ)、 12. 5 μ L 2x.GoTaq? Green Master Mix (promega)和 10. 5 μ L 无 DNA 酶水组成。扩增条件 为：95°C预变性 4min，然后 95°C 40s，52°C 30s，72°C 35s 循环 25 次，最后 72°C延伸 5min。 PCR产物一部分用作内引物扩增的模板。 内引物（EMISnF/EMISnR)扩增体系和条件：扩增体系共25yL，由I yL外引物扩 增的PCR产物、(λ 4yL正向内引物EMISnF(K) μ M)、0· 4 μ L反向内引物EMISnR(K) μ M)、 12. 5 μ L 2xGo f'aq? Green Master Mix (promega)和 10. 7 μ L 无 DNA 酶水组成。扩增条件 为：95°C预变性 3min，然后 95°C 35s，53°C 30s，72°C 20s 循环 22 次，最后 72°C延伸 5min。 取其中一个池的8尾虾苗的套式引物PCR产物与外引物PCR产物一起经I %琼脂 糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。从电泳图可以看出，外引物扩增结果全为阴性（泳道 9~16)，而套式引物扩增结果全为阳性（泳道1~8)，条带明亮而单一。所有阳性结果经 测序验证，均为虾肝肠胞虫。外引物和套式引物对4个养殖池虾苗的检测结果见表1。 检测结果说明：1、虾苗中虾肝肠胞虫含量极低；2、套式引物（EMISF/EMISR和 EMISnF/EMISnR)的检测灵敏度很高且特异性好，适合含量极低和组织量很小的虾苗中虾肝 肠胞虫的监测，适用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫微量感染或潜伏感染的早期监测和预警。 表1外引物和套式引物对虾苗中虾肝肠胞虫的扩增结果【主权项】1. 一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物，其特征在于：所述套 式引物包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物，其特征在于：所述套式引物包括一对外引物EMISF/EMISR和一对内引物EMISnF/EMISnR，具体序列如下：EMISF：GCGGTAATTCCAACTCCAAG；EMISR：TAAGCAGCACAATCCACTCC；EMISnF：AGTAGCGGAACGGATAGGGA；EMISnR：ACCCAGCATTGTCGGCATAG。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周俊芳，房文红，周红霞，王元，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。