微管修饰化合物制造技术

一种化合物，由至少一种成分A和至少一种成分B组成，所述成分A包含针对患病增殖细胞胞外表面结构的结合结构域，其在所述化合物的成分A结合时内化，所述成分B特征在于其为多肽，所述多肽的氨基酸序列包含微管相关蛋白(MAP)或包含MAP的至少部分序列，所述部分序列保留所述MAP与微管的结合功能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微管修饰化合物本专利技术涉及化合物，编码本专利技术化合物的多核苷酸，制备本专利技术化合物的方法，包含本专利技术多核苷酸的载体，包含本专利技术载体的细胞，包含本专利技术化合物的药物以及所述化合物用于治疗增殖性疾病的用途。重组免疫毒素是主要用于治疗癌症的嵌合蛋白。这些蛋白由结合结构域和毒性结构域组成，所述结合结构域通常是抗体或其片段，所述毒性结构域是通常来自细菌或植物的蛋白。抗体与靶细胞抗原结合后，免疫毒素内化，随后经胞内体处理并最终将毒素释放到胞浆中，在此展示其毒素活性。除了抗体作为靶向单元，还使用一些包括生长因子的配体[1-4]。在免疫毒素研发之初，抗体与毒素通过化学偶联缀合，然而这具有许多缺点，例如需要分别生产和纯化靶向单元和毒性单元，缀合后的产量低，以及非定向偶联导致的异质蛋白制备[5]。为了克服这些缺点并允许商业开发免疫毒素，通过遗传融合配体和基于蛋白的毒素产生单链DNA构建体，以产生重组免疫毒素。迄今为止，大多数免疫毒素能由转化的大肠杆菌发酵或由哺乳动物或酵母细胞很容易地表达，并通过标准层析法纯化。迄今所用的最优异的毒素是植物来源的蓖麻蛋白，尤其是其A链，以及细菌性假单胞菌外毒素A(ETA)和白喉毒素(DT)[6]。这两种细菌性毒素是多结构域蛋白，其包含由易位结构域分隔的细胞结合结构域和毒性结构域。用于免疫毒素，截短形式的ETA和DT通过缺失细胞结合结构域产生。这分别减小了ETA和DT的尺寸，使其更适于用作融合蛋白，并增强它们的特异性，防止与健康细胞不期望的结合[7-11]。最优异的截短形式的ETA被命名为PE38(本文称为ETA')[10]。历史上，由于其相对较强的副作用，免疫毒素仅限于在威胁生命的疾病中使用。因此，其临床用途被限于例如癌症等适应症。就在最近，Madhumthi和Verma综述了免疫疗法现有的治疗性靶标，强调癌症，包括实体瘤、淋巴瘤和白血病，是经典免疫毒素最主要的适应症[12]。除了其毒性副作用，由鼠或人抗体和细菌或植物毒素组成的嵌合免疫毒素的免疫原性不得不被认为是对治疗的阻碍[13]。自身免疫系统产生的中和性抗体会导致低生物活性的免疫毒素，由此需要施用更高剂量。人们已经进行了不同尝试以降低免疫原性。例如，ETA上推定的T和B细胞表位已经被鉴定和突变，以期获得更人源化形式的细菌性毒素[14,15]。另一种策略是使用聚乙二醇对免疫毒素进行修饰，这已证实能有效防止干扰素和L-天冬酰胺酶的免疫原性[16-18]。然而，这些策略无法显著降低免疫原性。由毒素与内皮细胞结合所引发的血管渗漏综合征是嵌合免疫毒素的另一个缺点。作为应对措施，人们已经采用了受体突变、防止与内皮细胞结合的抑制剂以及施用抗炎性剂等措施[19]。另一方式是产生完全人源的细胞溶解性融合蛋白。与人蛋白融合的完全人源的抗体片段日益获得关注，其能够直接或间接引发凋亡。人的核糖核酸酶例如RNase1、2、3和5(血管生成素)，已被用作酶，其降解RNA并通过抑制蛋白合成引发凋亡[20]。Huhn等人证实由CD30配体(CD30L)递送的人血管生成素对过表达CD30的霍奇金淋巴瘤来源的细胞系的特异性细胞毒性[21]。Tur等人制得完全人源的基于CD30L的免疫激酶，并证实与人类死亡相关的蛋白激酶2在体内和体外对几种霍奇金淋巴瘤细胞的特异性细胞毒性[22,23]。促凋亡蛋白例如Bik、Bak、Bax、DNA断裂因子40、FAS配体、TNF相关的凋亡诱导配体被证实在黑色素瘤、肾癌、皮肤T细胞淋巴瘤和AML中有效[24]。由抗CTLA4的单链片段(scFv)和穿孔蛋白组成的新的人类细胞溶解的融合蛋白被证实在体外杀死CTLA阳性细胞系[25]。有效的经典抗癌剂是细胞生长抑制分子，其能够干涉有丝分裂过程。根本上，它们的细胞毒性由使微管稳定或不稳定而体现，已知微管对质量和动力学变化敏感。与细菌或植物来源的毒素类似，细胞生长抑制小分子被认为是外源物，导致不希望的副作用。专利技术概述本专利技术的一个目标是提供治疗增殖性疾病的有效药物。本专利技术的另一个目标是提供能够治疗增殖性疾病的化合物。本专利技术进一步的目标是提供基于具有降低副作用的化合物的药物。附图简要说明图1：示出基于MAP的人细胞溶解性融合蛋白的开放阅读框的构造。图2：示出基于MAP的人细胞溶解性融合蛋白的完整表达盒。图3：示出序列ID1-13。图4：示出经IMAC和SEC纯化后不同的基于MAP的人细胞溶解性融合蛋白的12％SDS-PAGE凝胶。图5：示出由流式细胞术评估的纯化的基于MAP的人细胞溶解性融合蛋白的细胞结合活性。图6：示出细胞毒性分析结果。图7：示出AnnexinV/PI测定结果。图8：示出H22(scFv)-MAP成功排除hCD64阳性的炎性巨噬细胞。图9：示出对应于序列ID14-24的人MAP的ORF。本专利技术涉及一种化合物，其由至少一种成分A和至少一种成分B形成，所述成分A包含针对患病细胞胞外表面结构的结合结构域，其在所述化合物的成分A结合时内化，所述成分B特征在于其为多肽，所述多肽的氨基酸序列包含微管相关蛋白(MAP)或包含MAP的至少部分序列，部分序列保留了MAP与微管的结合功能。在具体实施方案中，本专利技术的化合物是人细胞溶解性融合蛋白。技术人员已知MAP的物质是一类特定化合物，其与微管显示限定的相互作用。技术人员对该术语最新的理解，举例来说概述于Wikipedia(http://en.wikipedia.org/wiki/Microtubule-associated_protein)。应当注意，与经典方式相比，如今我们惊讶地发现，当选择酶作为免疫毒素中的毒性实体时，MAP与作为不显示酶活性实体的靶向性蛋白的偶联能抑制细胞增殖。然而以下代表现有技术的参考文献正在使用的经典方式。BettinaStahnke等人在GranzymeB-H22(scFv),ahumanimmunotoxintargetingCD64inacutemyeloidleukemiaofmonocyticsubtypes,MolecularCancerTherapeutics,vol.7,no.9,pp.2924-2932中公开了一种新的完全人源免疫毒素，其由作为结合配体的抗CD64抗体片段[H22(scFv)]和作为效应物的人丝氨酸蛋白酶粒酶B(Gb)组成。在HEK293T细胞中成功产生并经亲和层析纯化后，作者证实Gb-H22(scFv)在体外具有针对CD64+白血病细胞的促凋亡活性。除了细胞系，Gb-H22(scFv)还显示针对原代CD64+急性髓样白血病细胞的特异性活性。与使用游离的细胞溶解性Gb相比，该文首次报道了完全人源的基于Gb的免疫毒素。在MrudulaMathew等人的Humanizedimmunotoxins:Anewgenerationofimmunotoxinsfortargetedcancertherapy,CancerSciencevol.100,no.8,pp1359-165中，作者综述了嵌合免疫毒素的整体方面，其通常包含细胞结合配体和化学连接或遗传融合的毒素，所述毒素通常来自细菌或植物。作者指出，尽管这些免疫毒素在临床前期研究中获得成功，但脱靶效应和免疫原性经常限制它们在临床中的应用。作为应对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物，由至少一种成分A和至少一种成分B组成，所述成分A包含针对患病增殖细胞胞外表面结构的结合结构域，其在所述化合物的成分A结合时内化，所述成分B特征在于其为多肽，所述多肽的氨基酸序列包含微管相关蛋白(MAP)或包含MAP的至少部分序列，所述部分序列保留所述MAP与微管的结合功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.24 EP 12189804.31.一种化合物，由至少一种成分A和至少一种成分B组成，所述成分A由针对患病增殖细胞胞外表面结构的结合结构域组成，其在所述化合物的成分A结合时内化，其中所述胞外表面结构选自CD64、EGFR、AchR、EpCAM和CD30，所述成分B特征在于其为多肽，所述多肽的氨基酸序列由微管相关蛋白(MAP)或MAP的至少部分序列组成，所述部分序列保留所述MAP与微管的结合功能。2.根据权利要求1的化合物，其中成分A选自以下内化的细胞表面受体的结合结构：抗体或其保留抗原结合功能的片段，其中所述抗体片段选自Fab、F(ab')2和Fv。3.根据权利要求2的化合物，其中抗体片段是scFv。4.根据权利要求1的化合物，其中成分B选自以下：微管相关蛋白MAP；驱动蛋白；具有SEQIDNO36-38的KIFCl-3；Tau蛋白；桥尾蛋白以及筑丝蛋白。5.根据权利要求4的化合物，其中微管相关蛋白MAP的氨基酸序列选自SEQID:57-65。6.根据权利要求4的化合物，其中驱动蛋白是氨基酸序列选自SEQIDNO14-35的KIF1-27。7.根据权利要求4的化合物，其中Tau蛋白是氨基酸序列为SEQIDNO1的磷酸化位点缺失的Tau蛋白。8.根据权利要求4的化合物，其中桥尾蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO56。9.根据权利要求4的化合物，其中筑丝蛋白是氨基酸序列选自SEQIDNO73-77的TEKT1-5。10.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其由成分A和KIF1、成分A和KIF2A、成分A和KIF4A、成分A和KIF5A、成分A和KIF5B、成分A和KIF6、成分A和KIF7、成分A和KIF9、成分A和KIF10、成分A和KIFll、成分A和KIF12、成分A和KIF13B、成分A和KIF14、成分A和KIF15、成分A和KIF17、成分A和KIF19、成分A和KIF22、成分A和KIF23、成分A和KIF24、...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·巴斯，西奥菲勒斯·泰佩，季米特里·赫里斯托多尔夫，拉多斯拉夫·姆拉德诺夫，
申请(专利权)人：弗劳恩霍夫应用研究促进协会，
类型：发明
国别省市：德国;DE