本发明专利技术涉及一种河豚鱼物种鉴别方法，以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像；在10µL的PCR产物中，加入2.0µL 10× Cut smart Buffer、1.0µL限制性内切酶NmeA Ⅲ、0.05µL S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SMA）溶液，再加纯净水6.95µL使总体积达到20µL，在37℃条件下消化16～18h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与成像拍照。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种应用限制性内切酶III确证PCR结果的河豚鱼物种鉴别方 法。
技术介绍
我国海域广阔，河豚鱼种类繁多，鱼类加工食品中因混有河豚鱼，使得消费者误食 而中毒的事件时有发生，2007年发生了由于出口美国的銨鱅鱼混有河豚鱼，导致顾客误食 而中毒的事件，这些事件对我国食品出口贸易造成负面影响。同年日本食品检验部门在我 国南方某食品有限公司出口的马面鱼干中检出河豚鱼成分。为了保证消费者的健康与权 益，保障水产加工制品的质量与安全，急需一种能够在食品中快速检测出河豚鱼成分的方 法。本研宄基于作者于2011年建立的河豚鱼成分检测PCR方法 检测河豚鱼与其他样 品，发现在金枪鱼与鲈鱼中也能扩增出与河豚鱼DNA片段大小（423 bp)接近的PCR产物， 产生了假阳性结果。因此，本实验应用限制性内切酶与DNA测序方法，分析了 13种河豚鱼 样品与2种非河豚鱼(金枪鱼与鲈鱼）的PCR结果的差别，经序列分析验证，建立了有效的 排除假阳性结果的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼 物种的快速鉴别方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，建立了有效的排除假阳性结果 的方法，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，建立河豚鱼物种的快速鉴别 方法。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，所述引物为HT-IF : 5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R :5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。 -种河豚鱼物种鉴别方法，所述方法包括如下：以优化后确立的DNA提取CTAB方 法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝 胶成像；在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μL IOX Cut smart Buffer、1.0 μL限制性内 切酶他?6^111、0.05卜1^5^腺苷甲硫胺酸（5^1(1611〇87111161:11；[011；[116，3麻）溶液，再加纯净水 6. 95 PL使总体积达到20 μL，在37 °C条件下消化16~18 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳与 成像拍照。 所述的DNA提取CTAB方法为：称取100 mg样品各两管于2. 0 mL离心管中，加入 600 yL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 yL，经超声波处理5 min;加入600 yL三氯甲烷， 13400 r · mirT1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0. 5 % CTAB溶液，颠倒混勾， 室温静置约1.5 h;在13400 r^mirT1条件下离心25 min，取沉淀，加入约400 μ L NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μ L Rnase酶37 °C条件下温浴约1.5 h;加入等体积的三 氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，三者的体积比为25 :24 :1，，颠倒数次充分混合后，在13400 r · mirT1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10体积的 NaAc溶液，祸旋30 s，充分混合后，在13400 r .mirT1下离心15 min ;取沉淀，加入400 μ L 70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 条件下离心洗涤沉淀10 min; 经DNA浓缩仪干燥10 min，加100 μ L TE (pH 8.0)在65 °C条件下溶解15 min，放入4 °〇冰箱保存待用。 PCR扩增反应体系为：2XTaq PCR MasterMix 10 yL，上下游引物（10 μΜ)各0· 8 4 1^，0嫩模板量250叩，！120为7.2以匕扩增程序为：94°0预变性5 1^11，94°0变性30 s，64 °C退火30 s，72 °C延伸30s，反应循环40次，最后72 °C延伸5 min。 本专利技术涉及河豚鱼成分PCR检测结果的限制性内切酶肠 eA III酶切确证方法。 应用限制性内切酶III对河豚鱼疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分 析，电泳图谱与河豚鱼阳性对照不同的样品，判定为假阳性结果，电泳图谱与阳性对照相同 的河豚鱼加工样品，确证为阳性结果，即检出河豚鱼成分，并经序列分析验证，建立了简便 高效的河豚鱼成分PCR检测结果的确证方法。 本专利技术的优点在于：可以快速、精准鉴别河豚鱼物种与非河豚鱼物种，有效排除有 毒物质河豚鱼成分检测中可能产生的假阳性结果。【附图说明】 图1引物HT-I对河豚鱼的PCR扩增结果；1.黑腮兔头飩；2.兔头飩；3.暗纹东 方飩；4.黄鳍东方飩；5.棕斑腹刺飩；6.红鳍东方飩；7.暗鳍腹刺飩；8.月腹刺飩；9.横纹 东方飩；10.河豚鱼加工鲜肉；11.河豚鱼干I ;12.鲈鱼；13.河豚鱼干2 ;14.河豚鱼干3 ; 15.金枪鱼；16.大黄鱼；17.鳗鱼；18.带鱼；19.空白对照（CldH2O) ;M. DNA marker I。 图2 PCR产物及其酶切结果电泳图谱；其中M. DNA marker I ;1、2.黑腮兔头飩； 3、4.兔头飩；5、6.暗纹东方飩；7、8.黄鳍东方飩；9、10.棕斑腹刺飩；11、12.红鳍东方飩； 13、14.暗鳍腹刺飩；15、16.月腹刺飩；17、18.横纹东方飩；19、20.河豚鱼加工鲜肉；21、 22.河豚鱼干1;23、24.鲈鱼；25、26.河豚鱼干2;27、28.河豚鱼干3;29、30.金枪鱼。奇 数号泳道为酶切消化后的产物电泳图谱，偶数号泳道为未经酶切的PCR产物电泳图谱。 图3河豚鱼（兔头飩）分?織分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III 酶切位点；下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 为酶切 位点。 图4金枪鱼分?/?部分片段PCR产物碱基序列与限制性内切酶III酶切位点 NEB cutter分析图，下划线部分与HT-I引物(表2)部分同源，框内碱基GCCGAG + (N)19 Λ NNt为酶切位点。 图5鲈鱼分?/τ部分片段PCR产物碱基序列。【具体实施方式】 材料与方法 1. 1材料来源 9个已知物种名称的河豚鱼样品、4个未知种类的河豚鱼样品、5个非河豚鱼样品（表 1)搜集自福建省莆田、厦门、福州等地水产养殖场、农贸市场和超市。 表1 18个河豚鱼及其他鱼类供试样品1. 2试剂 试剂来源：10 X buffer与T^i7HdNTPs购自上海生工有限公司，限制性内切 酶MwA 111(2000 U/mL)购自北京纽英伦生物技术有限公司，引物委托上海生工有限公司合 成。 引物合成 由上海生工生物工程有限公司合成河豚鱼成分检测引物（HT-1)，引物碱基序列、PCR 产物片段长度与适合的退火温度（^值）见表2。 表2河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度I. 4. DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶消化 以优化后确立的DNA提取CTAB方法与PCR引物、扩增体系和温度程序，进行DNA提取、 PCR扩增、PCR产物凝胶水平电泳与凝胶成像，每个PCR重复3次。按照产品使用说明书规 定，在10 μL的PCR产物中，加入2.0 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于河豚鱼物种鉴别方法的PCR引物，其特征在于：所述引物为HT‑1F：5'‑TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG‑3'；HT‑1R：5'‑GGGAAGGACATAGCCCACGA‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈文炳，翁国柱，邵碧英，缪婷玉，江树勋，彭娟，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建;35
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