一步均相化学发光法进行小分子检测的方法及所用微粒技术

本发明专利技术公开了一种用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒，首先，用兽药分子标记载体蛋白；其次将标记好兽药分子的载体蛋白偶联在均相化学发光受体球珠上去；然后，制备偶联有兽药分子抗体的均相化学发光供体球珠。本发明专利技术还公开了利用上述微粒采取的一步均相化学发光法进行小分子检测的方法。本发明专利技术提供的一步法均相化学发光技术，用于均相、快速、高灵敏度的兽药残留检测，以及用于饲料中常见的兽药成分含量测试，如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于小分子检测的一步法均相化学发光方法及所用微粒(包括受体微粒和供体微粒)。
技术介绍
现代牧业的规模化和集成化生产日趋成熟，为保证畜禽快速健康地生长，越来越多的兽药用于实际养殖中，但不合理的兽药使用往往造成严重的兽药残留，对现代人的生活品质带来深远的社会问题。根据WHO组织的规定，兽药残留指动物产品的任何可食用部分所包含的原兽药及其代谢物和伴生的杂质。据报道，目前兽药残留已超过120类之多，而beta-兴奋剂(beta-肾上腺素能受体阻断剂)就是其中的一大类。Beta-兴奋剂是一类苯乙醇胺类衍生物，临床上用来治疗哮喘、支气管痉挛等呼吸系统疾病，20世纪80年代发现，此类药物可减少脂肪积累，提高胴体肉脂比，促进骨骼肌生长，故被国内外很多养殖场用作食品添加剂，但人类食用含该类兽药超标的肉品后，易出现食物中毒、心血管疾病、新生儿畸形、提升肿瘤爆发率等病症，目前常被滥用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林这几种。克伦特罗(CBL)，CAS:129138-58-5，是一种平喘药，俗称“瘦肉精”，是最早被发现并滥用的beta类兴奋剂，CBL脂溶性好，吸收快，但在动物体内半衰期长，易残留，人食用含CBL的肉品危害甚大，现已禁止CBL用在动物养殖中。取而代之的是莱克多巴胺和沙丁胺醇等，它们在动物体内毒副作用小，清除时间短，而且增加瘦肉的效率非常高，一吨饲料中加入莱克多巴胺不到二十克，就可以让最后长肉阶段的猪增加24％的瘦肉，减少34％的脂肪。FDA规定莱克多巴胺在猪肉中允许值是50ppb(50微克/公斤)，牛肉中不得超过30ppb。沙丁胺醇、特布他林等却对人体健康危害过大，目前已在全球禁用。以下是这几种化合物的分子结构。目前针对该类药物的检测方法主要有色谱技术、免疫吸附试验等。色谱技术包括HPLC、LC/MS、GC/MS、GC/FTIR等，可从动物的组织、毛发中检测出残留量，非常高效、敏感、准确，但设备费用昂贵，样品处理繁琐，一次处理的样本少，无法现场检测；免疫检测技术，如酶联免疫ELISA技术，利用待检测的样品与酶标物结合，产生OD值的变化，定量药品的残留值，一次可以检测多份样品。但该技术对于操作步骤多，对专业程度要求高，操作易出现假阳性结果，造成漏检误检；胶体金免疫层析试纸条是也被用于兽药残留检测，但是由于方法学的原因，检测灵敏度不高，稳定性差，容易出现假阳性。应国家食品检验部门和实际应用要求，研制灵敏，快速，准确的兽药检测方法，检测畜禽的可食用组织及饲料中兽药残留，特别是克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等几种，有着重要意义。AlphaScreen(Amplified Luminscent Proximity Homogeneous Assay Screen)技术是一种基于微粒与微粒之间靠近的效应用于分析物的均相检测方法，是由1994年专利技术的LOCI(Luminescent Oxygen Channeling Assay)这种技术的基础上演化而来。供体含包裹有酞菁分子，受特殊波长680nm光激发，每秒可产生6万个以上单线态氧分子，放大信号，但单线态氧半衰期仅为4us，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等，接近供体，则受体中的荧光基团可迅速吸收单线态氧，以上转换方式产生520-620nm光信号，为检测器探测到。而Alphalisa则是在AlphaScreen技术的基础上，与经典的ELISA技术有相似之处的均相检测方法，我们称之为均相化学发光技术。因为这种方法不用洗涤，反应在均相跟中进行，其过程其实是个化学发光的过程。已广泛用于药物筛选，其检测原理如图1所示。AlphaLISA方法的核心是供体(感光微粒)和受体(发光微粒)这两种直径约为200nm的微粒。在两种微粒表面与生物分子(抗体或抗原蛋白)相偶联，每个微粒表面可以覆盖成百上千个生物分子,可捕获待测分子。当微粒受到680nm的激光照射后,供体表面的光敏剂就会将溶液(AlphaLISA反应液)中的氧气转化为单线态氧。单线态氧在溶液中的传播距离约为200nm,如果供体和受体之间的距离小于200nm,单线态氧就能扩散至受体微粒,受体中的光敏化合物就能和单线态氧发生化学反应，其中Eu3+配合物就产生高能级的发光。相反,如果发光微粒和感光微粒的距离大于200nm,单体氧无法扩散至发光微粒,就不会有光信号的产生。AlphaLISA均相反应就是基于以上原理,如果包被在两种微粒表面的生物分子存在相互作用时,就拉近了两种微粒之间的距离,产生光信号。通过对光信号的强度检测,来判断实际检测样品中有无待测目标物。基于AlphaLISA技术的原理,分子复合物小于200nm的范围内都可被检测到。而其他均相技术,例如时间分辨荧光(TR-FRET)、荧光偏振(FP),供体和受体之间的距离只能在为10nm内,仅限于小分子的检测。AlphaLISA可以应用于酶活性、受体配体反应、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳水化合物等检测。均相化学发光检测生物分子，可以不用洗涤，这是它的一大优点。但是，这种方法也有其不足之处：①灵敏度在检测生物样本时往往较低(灵敏度一般仅为1ng/ml)。检测血液、尿液时，由于样本的基质效益及样本中的物质对发光微粒所发出的光有吸收作用，检测灵敏度没有在PBS等反应液中的高；②受体微粒中的物质为噻吩和Eu3+配合物，这些物质都要包裹在200nm的聚苯乙烯微球中，还要有合适的比例，制备困难；③微粒中的物质多，Eu3+配合物包裹量就少，这影响微粒的发光强度和量子产率，影响了灵敏度；④检测仪器昂贵，影响了该方法的推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的一步法均相化学发光技术，用于均相、快速、高灵敏度的兽药残留检测，以及用于饲料中常见的兽药成分含量测试，如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒：一、受体微粒的制备方法为包括如下步骤：①、将兽药小分子和载体蛋白偶联，经PBS透析，得到标记有兽药小分子的载体蛋白；所述兽药小分子与载体蛋白的摩尔比为10～50:1；②、按照每0.05mmol的ATTA-Eu3+配用0.9～1.1g(较佳为1g)聚苯乙烯微球的用量比，在ATTA-Eu3+中加入聚苯乙烯微球溶液，超声包裹；得到含均相化学发光受体微粒的溶液；③、在均相化学发光受体微粒表面包被标记有兽药小分本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒，其特征是：一、受体微粒的制备方法为包括如下步骤：①、将兽药小分子和载体蛋白偶联，经PBS透析，得到标记有兽药小分子的载体蛋白；所述兽药小分子与载体蛋白的摩尔比为10～50:1；②、按照每0.05mmol的ATTA‑Eu3+配用0.9～1.1g聚苯乙烯微球的用量比，在ATTA‑Eu3+中加入聚苯乙烯微球溶液，超声包裹；得到含均相化学发光受体微粒的溶液；③、在均相化学发光受体微粒表面包被标记有兽药小分子的载体蛋白：将步骤②所得的含均相化学发光受体微粒的溶液进行清洗，得清洗后均相化学发光受体微粒；取清洗后均相化学发光受体微粒0.2ml，加入0.09～0.11mg标记有兽药小分子的载体蛋白，再加入9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理，得标记有兽药小分子‑载体蛋白的均相化学发光受体微粒；二、供体微粒的制备方法为：将醛基化AlphaLISA供体微球与上述兽药小分子相对应的抗体相偶联；包括如下步骤：含有1mg醛基化AlphaLISA供体微球的溶液经离心和分散沉淀的处理后，加入0.09～0.11mg与上述兽药小分子相对应的抗体和9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理，得带有兽药小分子抗体的均相化学发光供体微粒。...

【技术特征摘要】
1.用于兽药小分子检测的微粒，包括受体微粒和供体微粒，其特征是：
一、受体微粒的制备方法为包括如下步骤：
①、将兽药小分子和载体蛋白偶联，经PBS透析，得到标记有兽药小分子的载体蛋白；
所述兽药小分子与载体蛋白的摩尔比为10～50:1；
②、按照每0.05mmol的ATTA-Eu3+配用0.9～1.1g聚苯乙烯微球的用量比，在ATTA-Eu3+中加入聚苯乙烯微球溶液，超声包裹；得到含均相化学发光受体微粒的溶液；
③、在均相化学发光受体微粒表面包被标记有兽药小分子的载体蛋白：
将步骤②所得的含均相化学发光受体微粒的溶液进行清洗，得清洗后均相化学发光受体
微粒；
取清洗后均相化学发光受体微粒0.2ml，加入0.09～0.11mg标记有兽药小分子的载体蛋
白，再加入9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止
反应；所得的反应液经后处理，得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒；
二、供体微粒的制备方法为：将醛基化AlphaLISA供体微球与上述兽药小分子相对应的
抗体相偶联；包括如下步骤：
含有1mg醛基化AlphaLISA供体微球的溶液经离心和分散沉淀的处理后，加入
0.09～0.11mg与上述兽药小分子相对应的抗体和9～11uL浓度为350～450mM的氰基硼氢化
钠溶液，室温旋转反应18～24hrs后终止反应；所得的反应液经后处理，得带有兽药小分子抗
体的均相化学发光供体微粒。
2.根据权利要求1所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：
所述步骤一的受体微粒的制备方法中：
所述步骤②中：
所述聚苯乙烯微球的粒径为175nm；所述超声包裹为200w超声5s，停顿5s；如此重复
60次；
所述步骤③中：
含均相化学发光方法受体微粒的溶液进行清洗的方法为：将10ml含均相化学发光受体
微粒的溶液离心，弃上清液后加入7～9ml重悬液Ⅰ重悬浮；重复上述离心和重悬浮2～3次后再
离心，得清洗后均相化学发光受体微粒；
所述重悬液Ⅰ为8ml 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20；
所述后处理为：将所得的反应液离心，离心所得沉淀用重悬液Ⅱ重悬后超声分散，再离心，

\t得标记有兽药小分子-载体蛋白的均相化学发光受体微粒；所述重悬液Ⅱ为100mM Tris-HCL 
pH8.0。
3.根据权利要求2所述的用于兽药小分子检测的微粒，其特征是：
所述步骤二的供体微粒的制备方法中：
所述离心和分散沉淀的处理为：
取50uL浓度为20mg/mL的醛基化AlphaLISA供体球珠，加PBS缓冲液(pH＝7.4)稀
释，离心，吸走上清，加200uL 100mM Hepes(pH 7.4)，1.25uL 10％Tween-20，分散沉淀；

【专利技术属性】
技术研发人员：朱成钢，向闯南，江学成，易文，
申请(专利权)人：杭州金溪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33