高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法技术

一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法，该方法以油茶籽壳为原料，粉碎后经乙醇提取，收集提取液，用D-101大孔吸附树脂纯化后，以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001(体积比)作为高速逆流溶剂体系，对油茶籽壳提取物进行高速逆流色谱分离，制得2个黄酮类化合物。本方法简便，重现性好，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种黄酮类化合物的制备方法，具体涉及一种以高速逆流色谱法从油茶籽壳中分离制备黄酮类化合物的方法。
技术介绍
油茶(Camellia oleifera)属山茶科山茶属，种子可榨油供食用，茶籽壳即为外种皮，种皮含较多色素呈棕黑色，且较坚硬，占茶果重的30.6％-34.0％。油茶树是我国主要的木本油料树种之一，每年产油150万吨，茶籽壳为茶籽榨油后的副产物，是茶籽榨油前除去的种皮，其利用率却相对较低。研究表明，茶籽壳中富含茶皂素、黄酮、多糖、多酚、原花青素等成分，若能将茶籽壳加以有效利用，必将产生巨大的经济效益。现代研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生理功能及药理作用，其提取物可用于食品、药品、化妆品等产品中。因此充分开发利用油茶籽壳中的黄酮类化合物具有十分重要的现实意义，不仅可解决废物污染环境的问题，还可提高油茶的经济效益。高速逆流色谱法是一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，已在生物、医药、食品、材料等领域得到广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视，但以该高速逆流色谱法从油茶籽壳中分离制备黄酮类化合物的方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种高速逆流色谱<br>制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法，该方法步骤如下：A.油茶籽壳提取物的制备：取油茶籽壳粉，用为油茶籽壳粉6-12倍重量的50-70％质量浓度的乙醇提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇后通过装有D-101大孔吸附树脂的层析柱以2-3BV/h流速进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用3-4BV的水以4-6BV/h的流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为10％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱，再用30％质量浓度的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱至无色，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物；上述油茶籽壳粉是取油茶籽壳，粉碎过10目筛得到。上述步骤A中乙醇提取时的温度为50-60℃，提取次数为3次，每次提取时间为0.5-1h。B.高速逆流色谱法分离：按体积比以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速2mL/min、主机转速850rpm/min，分离温度20℃，检测波长280nm，上样量300mg的条件下，将上述制得的油茶籽壳提取物进行HSCCC分离，根据峰形分段收集流出液，将收集的流出液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得粉末状化合物1和化合物2，其结构分别如下：本专利技术以油茶籽壳为原料，其油茶籽壳提取物经大孔吸附树脂纯化后，采用高速逆流色谱法分离得到2个高纯度的黄酮类化合物，经质谱和核磁共振鉴定其结构，分别为山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]、和山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-L-阿拉伯糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷]。本方法简便，重现性好，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。附图说明图1是油茶籽壳原料HPLC色谱图。图2是HSCCC分离色谱图。图3是化合物1HPLC检测图及UV图(254nm)。图4是化合物2HPLC检测图及UV图(254nm)。具体实施方式实施例1 油茶籽壳中黄酮类化合物的制备本实施例中的油茶籽壳购于湖南省怀化市洪源农林开发有限公司。1、高速逆流(HSCCC)上样原料(油茶籽壳提取物)的制备取粉碎过10目筛的油茶籽壳粉200g，用为油茶籽壳粉6倍重量的70％质量浓度的乙醇在60℃下提取三次，第一次60min，后两次各30min，收集提取液，合并，过滤，55℃减压浓缩回收乙醇，得到的水层(提取液)通过装有300ml D-101大孔吸附树脂的层析柱以3BV/h的流速进行吸附，吸附后静置30min，先用900ml水以6BV/h的流速淋洗，然后用10％质量浓度的乙醇水溶洗脱900ml，流速3BV/h，再用30％质量浓度的乙醇水溶液洗脱900ml，流速3BV/h，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物，作为高速逆流上样原料。2、HPLC检测方法高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度为：90％的A和10％的B 35min之内变为68％的A和32％的B，维持此梯度10min。流速为1.0mL/min，DAD检测器，进样量为20μL，柱温:28℃。取少量的上述制备的油茶籽壳提取物用甲醇溶解，过膜进样，HPLC谱图见图1，由图可见，油茶籽壳提取物中含有多个化学成分，含量相对较高的有两种化合物，是保留时间分别为17.561min化合物1和19.887min化合物2。两组分的紫外光谱显示，在280nm和350nm处有较大吸收，符合黄酮类化合物典型紫外吸收特征，初步确定为黄酮类化合物。3、高速逆流色谱(HSCCC)分离3.1 溶剂系统的选择通过对多个亲水性体系进行筛选，发现水-冰乙酸-正丁醇-甲基叔丁基甲醚-乙腈组成的体系K值较好。将该体系中不同溶剂按下表1中的比例配制，震摇后静置分层。移取3mL下相加入少量上述制备的油茶籽壳提取物样品，用HPLC测定样品中在下相中各目标峰的面积S萃前。再取等体积上相进行萃取，测定萃后下相中目标峰面积S萃后，按下式(1)计算出各组分的分配系数K。根据K值选择适合的溶剂体系作为HSCCC的固定相与流动相。最终实验采用溶剂体系2即以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-冰乙酸(6：3：1：1：0.001，V/V)作为溶剂体系上样操作。式(1)：K＝(S萃前-S萃后)/S萃前表1 溶剂体系K值筛选表3.2 HSCCC操作条件高速逆流色谱柱：TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)：配置有聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱容积280mL，转速0-1000r/min，TBP-50A泵，TBD-2000UV检测器，LX-300恒温器。按上述配置溶剂体系2000m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法，其特征在于，该方法步骤如下：A.油茶籽壳提取物的制备：取油茶籽壳粉，用为油茶籽壳粉6‑12倍重量的50‑70％质量浓度的乙醇提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇后通过装有D‑101大孔吸附树脂的层析柱以2‑3BV/h流速进行吸附，吸附后静置30min‑60min，先用3‑4BV的水以4‑6BV/h流速淋洗，然后用4‑6BV质量浓度为10％的乙醇水溶液以2‑4BV/h的流速洗脱，再用30％质量浓度的乙醇水溶液以2‑4BV/h的流速洗脱至无色，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得油茶籽壳提取物；B.高速逆流色谱法分离：按体积比以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：冰乙酸为6：3：1：1：0.001作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速2mL/min、主机转速850rpm/min，分离温度20℃，检测波长280nm，上样量300mg的条件下，将上述制得的油茶籽壳提取物进行HSCCC分离，根据峰形分段收集流出液，将收集的流出液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得粉末状化合物1和化合物2，其结构分别如下：...

【技术特征摘要】
1.一种高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法，其特征在于，
该方法步骤如下：
A.油茶籽壳提取物的制备：取油茶籽壳粉，用为油茶籽壳粉6-12倍重量的
50-70％质量浓度的乙醇提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇后通过装
有D-101大孔吸附树脂的层析柱以2-3BV/h流速进行吸附，吸附后静置
30min-60min，先用3-4BV的水以4-6BV/h流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为
10％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱，再用30％质量浓度的乙醇水溶液以
2-4BV/h的流速洗脱至无色，收集30％质量浓度的乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，
得油茶籽壳提取物；
B.高速逆流色谱法分离：按体积比以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙腈：
冰乙酸为6：3：1：1：0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆英，李觅路，李嘉伟，刘毅，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43