本发明专利技术公开了一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒，本发明专利技术方法从地沟油中大量繁殖的细菌种类入手，分析污染地沟油的优势细菌，再确定其特异成分，来达到鉴别地沟油的目的，研究方法非常独特，利用地沟油中优势菌体的脂多糖，筛选单克隆抗体，建立脂多糖的TRFIA检测方法。本发明专利技术所述的方法具有对地沟油特异性强和检测灵敏度高的优点，在地沟油的鉴别检测中具有非常重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全和生化监测领域，特别涉及一种快速检测地沟油的时间分辨 荧光免疫方法及试剂盒。
技术介绍
地沟油是质量、卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛、AFBI (黄曲霉毒 素Aflatoxin Bl(AFBI))等指标严重超标的非食用油。餐饮业废弃油脂中含有大量的有毒 有害物质，人类食用后会产生头晕、恶心、呕吐、腹泻、失眠、乏力、消化不良、肝区不适和剧 烈腹绞痛等中毒症状，长期食用会出现贫血、营养不良，内脏受损，导致人体体重减轻和儿 童发育障碍，严重者还可能出现中毒性肝病，诱发胃腺癌、肾癌及乳腺、卵巢、小肠等部位癌 月中，长期食用对人体健康造成极大危害甚至致癌。有学者对泔水油进行了毒理学研宄。研 宄表明，饲喂泔水油的小白鼠120天后出现死亡现象，到180天死亡率达到60%以上，而对 照组的小白鼠没有出现死亡现象；实验组中小白鼠行动缓慢，有病状，肝脏表面有一个黄色 脂肪球，肝脏发黄，肝脏细胞变多，呈椭圆形，并有很多细胞处于分裂状态。地沟油中的重金 属、毒素（如丙烯醛）严重超标，过氧化值高于0.4%，远远超过国家标准0. 15%。长期摄 入会使细胞功能衰竭，诱发多种疾病，甚至致癌。日本曾发生食用过氧化值为7. 5 %的劣质 油脂而造成集体急性中毒事件。 我国饮食业发达，是全世界消耗食用油最大的国家。在我国，地沟油的原料获得比 较容易，并且工艺简单，几个简单的设备就可以加工，每年产生至少500万吨地沟油。由于 执法取证困难及违法成本低，在利益的驱动下一些不法投机者将地沟油用在食品中，对社 会和食品安全造成非常大的危害。目前国内尚无可靠的检测地沟油的方法，这使得执法部 门无法对市场进行有效的监控。要减少不法投机者将地沟油用在食品中，除提高违法者的 违法成本和建立市场准入制度外，还需要建立一套快速鉴别地沟油的检测系统，为执法者 执法时提供技术支持。 目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。现行的国家强制性标准《食用植物油卫 生标准》（2716-2005)中，关于食用油的理化指标检测包括酸价、过氧化值、浸出油溶剂残 留、游离酚（棉籽油）、总砷、铅、黄曲霉毒素、苯并芘、农药残留共9项指标，分别对植物原油 和植物食用油进行不同的标准检测。市场上已经有几种类型的快速检测技术或方法，分别 为：电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等快速检测方法，这些方法在应用上各有 优势，但都存在缺陷，如下所述： 电导率检测法：因为油脂在烹饪过程中接触了洗涤剂、金属器皿，或长期停留在重 金属环境中，因此地沟油的电导率值明显高于普通食用油。武汉工业学院曾经找到一种30 分钟内检测地沟油的方法。通过检测油的电导率，得出地沟油电导率是一级食用油的5~ 7倍的结论。这种方法对于"泔水油"的检测相对有效。然而它的缺陷在于仅仅适用于地沟 油添加量在20%以上的食品油检测；另外只适用于物理压榨法制备的油品，化学浸出法制 备的油品电解质高容易造成假阳性。 胆固醇检测法：因为地沟油是多种动、植物油脂的混合物，其中动物脂肪中普遍含 有胆固醇，而在人们食用的正规植物油中一般不含或只含有极少量的胆固醇。利用这一特 性可以鉴别出某些地沟油，但同样要求地沟油的添加量在10%以上。当有些食用油由于添 加了棕榈油，比较容易在低温条件下形成结晶造成假阳性。 薄层层析方法：由于地沟油和深度油炸油中含有大部分食用油所不含的醛、酮类 极性化合物，在展开剂作用下油样中的各种成分在硅胶板上扩散分离，经过显色剂显色后 可观察到色谱板上不同的薄层斑点，记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比 移值（RF)。拖尾斑中主要是醛、酮类极性化合物。但是薄层层析法对于一些未经纯化的油 (比如芝麻油、花椒油等）和加入其他成分的油（如辣椒油），容易出现假阳性。 综上所述，现有的方法准确度不高，特异性不强。2011年10月12日我国卫生部新 闻发言人邓海华透露，目前征集到的5种地沟油检测方法特异性不强，有关部门将再向社 会公开征集方法。因此，开发灵敏度高、特异性强的用于地沟油的检测技术迫在眉睫。 时间分辨焚光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是标记免 疫分析方法的一种。是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有 长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发 射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被 检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量 400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品 实施1秒钟的测量，意味着完成了 1000个周期的测量，测量精确度极高TRFIA方法学研宄 和临床应用的发展十分迅速，成为继RIA之后标记免疫分析发展的一个新的里程碑，已广 泛运用于蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针、细菌毒素和生物活性细胞的定量分析。TRFIA 技术已成为现代临床微量检验、分子生物学、细胞学和生物化学等生物医学研宄中非常有 发展前景的分析手段。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速检测地沟油的 时间分辨荧光免疫方法和试剂盒，本专利技术方法从地沟油中所大量繁殖的细菌种类入手，分 析地沟油的优势细菌，再确定其特异成分，来达到鉴别地沟油的目的，研宄方法非常独特， 目前国内没有前例。利用地沟油中优势菌体的脂多糖，建立单克隆抗体的检测试剂，能够更 特异、更经济，方便操作和使用。本专利技术提供的时间分辨免疫荧光学检测方法，操作简单、检 测时间短、灵敏度高的特点，能够弥补上述电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等 灵敏度低、特异性差的缺点。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案为： 一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法， 包括如下步骤：优势菌鉴定技术：本项目通过传统细菌分离培养技术、生化鉴定 技术、细菌数测定可以确认泔水中优势菌的种类；单克隆抗体制备技术；时间分辨免疫技 术 步骤一：优势菌筛选鉴定： (1)地沟油生产原料样品前处理：选取四份泔水样品，对每份泔水样品进行4个梯 度的稀释，其中加入石蜡和吐温80的目的是将油样乳化为水溶性溶液，具体方法如下：将 泔水样品原液每2ml与lml石蜡，2ml吐温80及15ml生理盐水混合，40 °C~44°C持续震荡 至混合均匀，之后每毫升样品加入9毫升生理盐水，混合均匀后再每毫升样品加入9毫升生 理盐水至混合均匀，备用； (2)培养细菌：前处理后，将每个样品的稀释前后不同浓度液体分别接种到麦康 凯（Mac Conkey)和伊红亚甲蓝（EMB)两种培养基，具体方法是取液体100 y 1加入到培养基 中央，然后用L型玻璃棒将液体均匀涂布到平板上，做好标记，置于电热恒温箱37°C培养， 18h~24h后观察菌落生长情况，将形态相近的菌落归类计数，然后挑选出有代表性的不同 形态的菌落接种到血平板，编号并标记来源，置37°C 18h~24h做纯化培养； (3)细菌鉴定：将纯化培养的菌落，对应每个菌落取相应数量的试管，每管加 3. 5ml生理盐水，用棉签在血平板上蘸取适量菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：优势菌筛选鉴定：(1)地沟油生产原料样品前处理：选取四份泔水样品，对每份泔水样品进行4个梯度的稀释，其中加入石蜡和吐温80的目的是将油样乳化为水溶性溶液，具体方法如下:将泔水样品原液每2ml与1ml石蜡，2ml吐温80及15ml生理盐水混合，40℃～44℃持续震荡至混合均匀，之后每毫升样品加入9毫升生理盐水，混合均匀后再每毫升样品加入9毫升生理盐水至混合均匀，备用；(2)培养细菌：前处理后，将每个样品的稀释前后不同浓度液体分别接种到麦康凯(Mac Conkey)和伊红亚甲蓝(EMB)两种培养基，具体方法是取液体100μl加入到培养基中央，然后用L型玻璃棒将液体均匀涂布到平板上，做好标记，置于电热恒温箱37℃培养，18h～24h后观察菌落生长情况，将形态相近的菌落归类计数，然后挑选出有代表性的不同形态的菌落接种到血平板，编号并标记来源，置37℃18h～24h做纯化培养；(3)细菌鉴定：将纯化培养的菌落，对应每个菌落取相应数量的试管，每管加3.5ml生理盐水，用棉签在血平板上蘸取适量菌溶于管内，控制菌悬液麦氏单位在0.5～0.63的范围内，标记后备用，然后将提前半小时从冰箱取出的GN卡插到管内，即可放入VITKE2全自动微生物鉴定系统，完成装载和菌种鉴定；(4)针对菌种制备特定脂多糖抗体。步骤二、脂多糖单克隆抗体制备及纯化(1)、样品收集：将地沟油样品加入试管中，加入蒸馏水，强烈震荡，待水油分离时取水相备用；(2)、间接竞争免疫分析检测步骤：取脂多糖‑BSA板条，每孔加入50ul脂多糖标准或上述步骤(1)处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液稀释的抗脂多糖单克隆抗体50ul，25℃振荡0.5h，洗涤液洗3次，没有连接到固相抗原上的脂多糖抗体在洗涤步骤中被除去，再加分析缓冲液稀释的Eu3+‑羊抗鼠抗体100ul，25℃振荡0.5h，用洗涤液洗6次，加200ul增强液振荡5min后测量，从标准曲线计算样品中的脂多糖含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李军涛，陈守义，朱伟，杨智聪，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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