儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方法。本发明专利技术通过比较活动性结核病组与健康对照组蛋白质组学差异，获得儿童活动性结核病的蛋白特征谱。此外，本发明专利技术还涉及儿童活动性结核病蛋白特征谱的构建方法，利用相对和绝对定量的非标记串联质谱技术，能有效地对血浆里的蛋白进行鉴定和相对定量，采用该技术能获得儿童活动性结核病人血浆中的蛋白表达差异质谱。本发明专利技术所发现的一系列蛋白质为寻找新的更理想的标志物提供了基础和资源；与以往的血浆学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选儿童活动性结核病的药物中；本发明专利技术同时也为探索疾病发生发展的机制提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质组学领域，涉及一种儿童活动性结核病蛋白特征谱及其构建方 法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的当今 世界上最普遍的传染病之一，是当前导致发展中国家儿童死亡的重要疾病之一。据估计，结 核病患儿已占全球结核病人总数的10% -15%，且该比率在结核病高发国家和地区如非洲 更高。我国作为结核病高发国家之一，0-14岁儿童结核感染率为9.0%，活动性结核病患病 率为91. 8/10万。随着近年来耐药结核杆菌的流行以及HIV病毒感染的增多，儿童结核病 出现明显回升趋势。因此，加强儿童结核病的早期诊断已经成为儿童结核病控制工作亟待 解决的问题。 儿童结核病长期面临诊断困难的问题。首先，儿童结核病通常细菌载量较低，咳嗽 反射和气管纤毛运动能力差，常常合并肺外结核而导致痰涂片阳性率很低。结核病患儿发 病早期临床症状尚不明显时，实验室不能及时提供准确的病原学诊断结果，常常延误诊断， 不能准确的选择有效药物，易引起病情恶化，失去抢救的最佳时机。免疫力低下、使用过免 疫抑制剂以及患有严重结核病的患儿，由于机体免疫应答减弱，常规免疫学诊断方法常常 出现假阴性，对早期诊断和预防治疗造成不良影响。 结核菌素皮试（Pro试验）是目前诊断结核病的重要辅助手段，但由于pro是多种 抗原的混合物，所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受 到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异度较差，常可导致假阳性结果。当患儿出现 免疫功能低下时可出现假阴性结果。pro试验诊断的特异度和敏感度还受其阳性判断标准 的影响，且目前国内pro试验在儿童潜伏结核感染诊断中的标准尚不统一，从而给临床医 师的诊断带来一定的困难。 γ干扰素释放试验作为一种新型的免疫学诊断方法已在欧美等国广泛应用于结 核病、结核性脑膜炎、结核病疗效评估等的常规诊断。由于该试验结果不受卡介苗接种的影 响，因此尤其适用于卡介苗接种率较高的人群。但目前关于该实验在儿童结核病诊断中的 准确性研宄结论尚不一致。有研宄认为γ干扰素释放试验不受小年龄的影响，在儿童中具 有较好的敏感度。而有的研宄则认为该试验即使在细菌培养阳性的儿童中，其敏感度也很 低，不适用于在儿童中作为一种常规的诊断方法，因此，探索新的适于儿童的诊断方法，达 到早期诊断早期治疗的目的势在必行。 蛋白质组学是在1994年由Williams和Wilkins提出的，通过寻找特异性蛋白质， 为研宄疾病机制提供线索。近年来随着人类蛋白质组学计划的全面启动，蛋白质组学的研 宄也产生了巨大进展，蛋白质组学研宄中应用的定量方法主要有两种，一种是基于传统双 向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量，包括标记定量技 术（iTRAQ)和非标记定量技术（Label free quantification)两种。非标记定量技术不 需要昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低；对样本的操作也最少，从而使其最接近原 始状态；并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺 陷，因此它在定量蛋白质组学研宄中受到了众多科学工作者的推崇，得到了越来越广泛的 应用。 近年来，蛋白质组学技术用于疾病诊断的研宄已日趋广泛，该技术通过对机体病 理改变引起的蛋白质产物的变化进行分析，运用化学计量学方法对疾病组和正常组进行辨 识，寻找疾病相关的生物标志物，并用于临床诊断。该诊断技术克服了传统医学诊断模式的 诊断准确率低、诊断指标单一、对专家诊疗水平依赖性强、治疗模式缺乏个体化等缺陷，充 分利用蛋白质组学产物进行系统分析，对各个状态都作出更准确和客观的评价，大大提高 诊断的科学化、定量化，并避免人为因素的误诊。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱 的构建方法。 本专利技术所提供的非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱的构建方法，具 体可包括如下步骤：分别从儿童活动性结核病患者组和健康对照儿童组的离体血浆中提取 总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测 和相对定量分析，根据分析结果获得儿童活动性结核病相关蛋白特征谱； 所述儿童活动性结核病相关蛋白特征谱中，所述儿童活动性结核病患者组和所述 健康对照儿童组中表达差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表 达上调的蛋白质有实施例表2中的前242种蛋白（即如上所述PTCD3至所述TRPM5);所述 表达下调的蛋白质有实施例表2中的后137种蛋白（即如上所述KIAA1211至所述ZNF225)。 其中，在提取总蛋白之后，还可包括去除高丰度蛋白、进行蛋白浓度测定的步骤。 在所述方法中，所述相对定量分析过程中，利用Trans-Proteomic Pipeline 软件提取一级质谱定量信息，利用ProfileAnalysis2. 0软件进行定量，并利用 ProteinScapd. 1软件进行数据检索和整合，筛选出比值> 2的蛋白为表达上调的蛋白，比 值〈0.5的蛋白为表达下调的蛋白，所述比值为所述儿童活动性结核病患者组的蛋白表达 量与所述健康对照儿童组的蛋白表达量的比值。 其中，所述利用ProteinScape2. 1软件进行数据检索和整合具体为：以Peptide FDR < 0. 05对数据进行筛选过滤，导入Maxquant软件进行Label free分析。主要参数如 下： Main search ppm ：6Missed cleavage ：2 MS/MS tolerance ppm ：20De-Isotopic ：TRUE enzyme ：Trypsin database ：ipi. human. 3. 87. fasta Fixed modification ：Carbamidomethyl(C) Variable modification :0xidation(M)，Acetyl (Protein N-term) Decoy database pattern ：reverse Lable free quantification (LFQ) ：TRUE LFQ min ratio count ：2 Match between runs ：2min Peptide FDR ：0. 05 Protein FDR ：0. 05 在所述方法中，所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，质谱条件如下： 分析时长为120min，检测方式为正离子，母离子扫描范围为300-1800m/z，多肽和多肽的碎 片的质量电荷比按照每次全扫描后采集10个碎片图谱的方式采集，MSl在M/Z200时分辨 率为70000, MS2在M/Z 200时分辨率为17500。 在所述方法中，所述液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测过程中，色谱为毛细管 高效液相色谱，色谱条件如下：色谱柱的填料为反向碳18,内径为150 μ m，柱长100 mm (如 Thermo EASY column SC200150 ym*100mm(RP-C18))，流动相由 A 液和 B 液组成，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非诊断目的的儿童活动性结核病相关蛋白特征谱的构建方法，包括如下步骤：分别从儿童活动性结核病患者组和健康对照儿童组的离体血浆中提取总蛋白，用胰蛋白酶进行酶解，对酶解所得多肽进行液相色谱‑电喷雾电离串联质谱检测和相对定量分析，根据分析结果获得儿童活动性结核病相关蛋白特征谱；所述儿童活动性结核病相关蛋白特征谱中，所述儿童活动性结核病患者组和所述健康对照儿童组中表达差异的蛋白质包括表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；所述表达上调的蛋白质有PTCD3、ADAMTSL2、HTT、SNX4、VPS37B、RANBP17、UBE2O、VWDE、MCM4、ZC3H11A、WIZ、CCDC81、DSP、MMP2、GEMIN5、SPIRE2、PC、ADCY3、LIMS2、WWC1、RP1、ADAM18、AARSD1、PCSK6、ST3GAL4、ZNF584、ZMYM1、XB、LRRK2、SOCS5、RASAL3、SMC3、ATP10A、KDM1A、TTLL10、HERC6、PCCA、C1QTNF1、NUP88、SORBS1、NKD2、PIWIL4、AKAP2、SYNM、NPM1、HP、NOS1、NLRP14、SKIV2L、ICE1、ASAP2、ABAT、ORM1、CASK、SPECC1、NIPBL、DOCK11、CACTIN、ZNF526、SYNRG、FANCD2、PLXNC1、SPATA31D1、FBXO46、PSG3、BMPR2、DKFZp434A2017、KIF4A、COX10、ARHGDIG、RASAL2、MYH7、RFC1、DOCK5、ATP11A、ANKRD27、ZNF521、ZNF281、DLL1、TBL3、MYH14、EML4、CLTCL1、PRRC2C、TSTD2、C1orf94、NSD1、GPR137B、FRMPD2、ANKRD33B、SIN3A、TAS1R1、KIF3C、CYP26B1、HERC2、DCAF12L2、CCDC15、SP140、ABCC12、WDR91、SEC31A、GTPBP3、TLR4、CHMP4B、HECW1、CP、C16orf71、PPP2R5D、COL13A1、ZBTB10、ZNF311、PINLYP、AIM2、KCNMB3、HAL、MTHFD1、ALPP、PPP1R9A、IFT81、DDX60、CCDC71、RNF152、UBR4、ASH1L、CORO1C、ACAN、NARG1L、ZNF831、ABCA2、HCFC1、REXO1、TRIP12、PCNT、CAD、AK3、GUSB、SERPINA1、MTUS2、ZNF606、ARAP3、DZIP1、POLR3C、NLRP13、IFNA14、DNAH7、GPAM、SAMD9L、LMO3、USP11、RASGRF2、TATDN2、DCAF17、POFUT2、LAMA2、AXIN2、AP2A2、KIAA1033、HPS6、SORT1、TNPO3、NHLRC1、ADAM15、SLC25A41、CLEC14A、SERPINA3、DRG2、SYCP1、MRPS18B、ATP12A、SERPING1、MACF1、RSAD1、VPS13D、TTC3、RIMS1、GRK6、SP110、SOWAHC、HDGFRP3、POLR2A、C10orf76、INTS2、PROZ、MYO7B、TRMT1、ARHGEF1、LCE3A、SLC38A10、A2M、PAMR1、MCM5、ANK2、KLK8、PRG4、ZMYM3、PPP2R1B、TSSK4、INPP5B、SKIL、ZNF543、SLCO3A1、ATR、MID2、ZFP57、TICRR、XRCC4、SPTBN2、AHCTF1、C2CD3、ZC3H12B、LOX、PLOD3、ACACB、SDK2、C9orf85、CASP8、PLAA、KAT8、UTRN、MROH8、DMTN、SAA1、NRXN2、LEPREL4、SMC5、SPATA31C1、SAMHD1、PIAS3、L1CAM、JADE1、PKD1L1、MDC1、FAT2、PSD4、TAP1、CEP290、TTC28、ABCA7、LONP2、RGAG1、TAB2和TRPM5；所述表达下调的蛋白质有KIAA1211、CGN、DDAH1、HHIP、CLIC3、PPP6C、PNN、PRPF8、KIT、GLMN、CCDC89、DNAH14、COL6A2、GFRA1、PRPF6、KIAA0319、ATP13A1、PHKG2、COL7A1、TRIP6、TRIM14、DNAJC1、PHLDB3、ICA1、PRPF4B、TFAP4、LACTB、CEP63、MYO19、ARHGAP19、ANKRD17、EYS、PRDM9、TIGD5、ECHDC3、RHBDF1、GLG1、TMEM141、TNS1...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：申阿东，李洁琼，孙琳，徐放，綦辉，肖婧，申晨，焦伟伟，郭雅洁，王咏红，佟月娟，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：北京;11