本发明专利技术公开了一种可用于特异性检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的信号标记分子及标记方法。所述的信号标记分子至少含有两个功能基团，其中一个功能基团可以与8-羟基脱氧鸟苷通过共价键连接，另一个功能基团可以产生检测信号。该信号标记分子在一定浓度氧化剂存在的条件下特异性的与8-羟基脱氧鸟苷反应，形成共价标记。根据该标记分子产生的信号，可以采用相应的检测方法，通过测量该标记分子产生的光、电、电化学发光或光电化学等信号，对8-羟基脱氧鸟苷进行定量检测。该标记分子对8-羟基脱氧鸟苷的连接和信号标记通过一步反应完成，反应条件温和，特异性好，标记率高，非常适合8-羟基脱氧鸟苷的快速、定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可用于检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的信号标记分子及标记方法。该方法操作简单，特异性高，可用于8-羟基脱氧鸟苷的定量分析。
技术介绍
8-轻基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxguanosine, 8-oxodG)被公认为是最主要的DNA氧化损伤产物标记物。8-OxodG的产生主要来自化学致癌物代谢活化或电离辐射等过程产生的大量活性氧类物质(reactive oxygen species, R0S)对DNA脱氧鸟苷C8位置的攻击。由于8-羟基脱氧鸟苷不仅能够跟碱基A配对，还可以跟碱基C配对，因此在DNA的复制过程，这种损伤常常导致G — T的突变。如果这种损伤未能得到及时修复，就会造成基因不稳定，进而产生基因或遗传毒性。在医疗诊断领域，病人尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量常被作为评价个体癌变危险或诊断与自由基相关疾病的生物标记物。科研文章中已经有很多关于8-羟基脱氧鸟苷检测的描述和报道。Floyd等提出的将DNA酶解后经高效液相色谱(HPLC)分离，然后利用电化学检测器(ECD)检测8-羟基脱氧鸟苷是一种非常有效的定量检测方法(参见文献:Floyd，RA.et al.Free Radic.Res.Commun.1986，1:163-172.)。该方法具有灵敏度高，样品需要量小，选择性好等优势。但实验操作繁琐，而且DNA的不完全酶解可能导致检测值比真实值高的结果。采用气质联用分析法(GC-MS)检测8-羟基脱氧鸟苷时，需要预先对8-羟基脱氧鸟苷进行衍生化，而衍生化反应很容易导致副产物的产生，造成假阳性的结果(Ravanat, JL.et al.Chem.Res.Toxicol.1995,8:1039-1045.) ο单克隆抗体和ELISA方法在检测8-羟基脱氧鸟苷时灵敏度高，重复性好，但存在交叉反应，并且抗体的制备不容易(Osawa T.et al.0xidativeStress and Aging.Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland，1995，ρρ367-374.)。近几年关于小分子荧光探针检测8-羟基脱氧鸟苷的研究逐渐增多。荧光探针不仅能够检测完整双链中的受损碱基，而且还可以在活细胞中实时检测，因此具有更大的应用前景。Sasaki等合成了一系列可用于检测8-羟基脱氧鸟苷的荧光探针，这类探针能够与8-羟基脱氧鸟苷形成多个氢键，因此具有很高的亲和力(Nakagawa, 0.et al.Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47:8983-8983.)。Burrows等发现,8-轻基脱氧鸟苷在氧化剂的作用下可以形成一种醌类物质，而该物质可以特异性的与精胺发生加成反应(Hosford, Μ.E.et al.J.Am.Chem.Soc.2004, 126:9540-9541.)。基于这个原理，约翰霍普金斯大学的Greenberg研究组合成了一种精胺-生物素(spermine-b1t1n, SB)化学标签。该标签中的精胺部分在氧化剂存的条件下可以与8-羟基脱氧鸟苷共价连接，然后利用酶标亲和素与生物素的作用，建立了一种类似酶联免疫荧光的方法检测DNA氧化损伤产物(Xue，L.et al.J.Am.Chem.Soc.2007, 129:7010-7011.)。该方法具有很高的特异性和灵敏度。前期研究利用精胺生物素和钌标亲和素对8-羟基脱氧鸟苷进行二步法特异性标记，构建的光电化学方法可以从520个正常碱基中检测一个8-羟基脱氧鸟苷。该检测中，电极上的8-羟基脱氧鸟苷在氧化剂的作用下先形成一种醌类物质，加入精胺-生物素对该醌类物质进行生物素标记，随后加入信号分子标记的链霉亲和素与生物素特异性结合，通过这两步反应完成对8-羟基脱氧鸟苷的信号标记。该方法还被用于研究DNA损伤修复酶Fpg(formamidopyrimidine-DNA glycosylase)对 8_ 轻基脱氧鸟苷的修复作用(Zhang, BT.et al.Anal.Chem.2013，84:6048-6053.)。
技术实现思路
本专利技术主要是针对现有技术以下几个方面的不足进行了改进:I)现有色谱技术前处理过程复杂；2)现有色谱技术对大型仪器要求高；3)现有荧光和免疫检测技术特异性不够理想；3)现有传感器技术需要二步法标记，操作较为复杂。为实现对以上方面的改进，本专利技术提供了一种可用于特异性检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的信号标记分子及标记方法。具体就是，合成一种信号标记分子，利用它特异性共价标记DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷，最终实现对DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的定量检测。与荧光探针比较，本方法提供的信号标记分子能够特异性结合8-羟基脱氧鸟苷，保证检测的准确性。与前期的精胺-生物素和标记链霉亲和素二步法相比，本方法提供的信号标记分子通过一步反应就可以实现对DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的标记，操作简单。本专利技术的一个方面提供了一种信号标记分子，该分子至少含有两个功能基团，其中一个功能基团可以与8-羟基脱氧鸟苷通过共价键连接，另一个功能基团可以产生检测信号。本专利技术的第二个方面提供了所述信号标记分子的合成方法，其包括下列步骤:(a)提供含有伯胺的功能基团作为与8-羟基脱氧鸟苷共价连接的部分；(b)提供可以产生检测信号的有机或无机功能基团；(C)将上述两种功能基团通过化学反应共价连接在一起，形成信号标记分子，用于检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷；本专利技术的第三个方面提供了一种快速、简便、有效的电化学发光检测方法，除了本专利技术的第二个方面步骤外，还包括下列步骤:(d)在氧化物存在的条件下，信号标记分子与DNA链中的8-羟基脱氧鸟苷共价连接;(e)测量信号标记分子的电化学发光信号，根据信号的强弱对样品进行定性或定量分析；其代表性的操作步骤是:(a)信号标记分子的合成与纯化；(b) DNA在表面的固定；(c)信号标记分子在氧化剂存在的条件下特异性地与DNA中8-羟基脱氧鸟苷共价连接；(d)测量信号标记分子给出的信号，根据信号的强弱对样品进行定性或定量分析。在本专利技术的一个方面中，所提供的可用于检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的信号标记分子，具有如下特征:该分子至少含有两个功能基团，其中一个功能基团可以与8-羟基脱氧鸟苷通过共价键连接，另一个功能基团可以产生检测信号。与其它化学探针比较，该信号标记分子通过一步反应就可以实现对8-羟基脱氧鸟苷的连接和信号标记，而且反应条件温和，特异性好，标记率高，非常适合8-羟基脱氧鸟苷的快速、定量检测。与其它探针分子比较，该信号标记分子合成简单，易于制得。 在本专利技术的另一个方面中，所述的信号标记分子对DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的标记方式为共价标记。在本专利技术的又一个方面中，氧化剂包括铁氰化钾、六氯铱酸钠和六溴铱酸钠等具有氧化特性的无机化合物。在本专利技术的一个实施方案中，DNA包括末端修饰有巯基的单链或双链多聚核苷酸。本专利技术主要是提供了一种可用于检测DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷的信号标记分子及标记方法，该分子通过简单的化学反应就可以制得。在氧化剂存在的条件下该信号标记分子通过一步反应即可完成对DNA氧化损伤产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于DNA氧化损伤产物8‑羟基脱氧鸟苷检测的信号标记化合物，其特征在于含有两个功能基团A和B，其中所述功能基团A能够与DNA中的8‑羟基脱氧鸟苷通过共价键连接，所述功能基团B能够产生检测信号。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭良宏，吴一萍，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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