水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用制造技术

本发明专利技术提供了水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用，通过将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株。其具体通过以下步骤完成：OsPHR2基因线性表达载体的构建；将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织；抗性再生植株的PCR鉴定。利用基因枪介导法将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2的线性表达载体导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株，为选育高产优质资源高效利用转基因小麦新品种提供技术和材料支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因育种
，具体涉及水稻低磷胁迫转录因子〇sPHR2在小 麦中的应用。
技术介绍
磷素是植物生长和发育所必需的大量元素之一，是核酸、磷脂和ATP等生命大分 子的重要组成成分，在植物的全生育期内起着极其重要的作用，全国土壤普查结果表明，我 国有近半数省（区）其总面积的50%以上的土壤有效磷含量在5mg/kg以下，土壤有效磷含 量在10mg/kg以下的占到80% -90%，土壤缺磷是作物生产的主要限制因素之一。当环境 中磷匮乏时，植物形态发育上的变化主要是根构型的变化，包括增加根茎比，侧根数目以及 根毛的数目和长度等。度等（陈Il等，2011 ;Abel et al，2011 ;Lopez_Bucio et al，2002 ; Ma et al，2001)。生理生化方面的变化包括高亲和Pi转运体的诱导表达，土壤分泌有机 酸，内源磷酸酶和RNase的诱导表达，以及增加有机酸和质子的释放，从而来增加磷的吸收 和再循环能力。 MYB转录因子中的MYB-CC家族基因成员是参与植物对营养成分饥饿胁迫调控过 程的重要基因。Wykoff等通过图位克隆的方法首先从拟南芥中克隆了 AtPHRl基因，并证明 该基因属于MYB-CC家族成员，参与了磷酸盐饥饿应答信号传导途径。浙江大学吴平教授课 题组从水稻中克隆了 2个拟南芥AtPHRl的同源基因 OsPHRl和0sPHR2,系统进化树分析表 明，OsPHRl和0sPHR2与AtPHRl同属于MYB-CC家族成员，两个基因都通过调节磷饥饿诱导 基因的表达而参与磷饥饿信号传导，具有相似的功能。但只有0sPHR2的超表达株系能够在 正常磷的环境下使水稻大量富集磷，且一些磷转运蛋白也相应的上调。在低磷条件下，过量 表达0sPHR2基因可提高植物根系对低磷信号的响应，植株根构型的改变较野生型株系更 为强烈，其结果是根增长，根毛增多，磷吸收利用率显著提高。0sPHR2是水稻磷信号调控体 系的重要因子，在土壤缺磷条件下可显著提高植物对磷的吸收。 本专利技术将0sPHR2基因导入到普通小麦品种郑麦0856中，创制出了可稳定表达与 遗传，无选择标记，且磷素吸收利用效率较受体郑麦0856明显提高的转基因小麦材料，为 选育节本高效优质转基因小麦品种提供技术和材料支撑。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2在小麦中的应用，通过构建 了水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2的线性表达载体，利用基因枪介导法将其导入到普通小 麦品种郑麦0856中，仓ij制出了可稳定表达与遗传，磷素吸收利用效率较受体郑麦0856明显 提尚的转基因小麦材料，为选育尚广优质资源尚效利用转基因小麦新品种提供技术和材料 支撑。 本专利技术具体通过以下技术方案实现： 本专利技术提供了水稻低磷胁迫转录因子0sPHR2在小麦中的应用，通过将水稻低磷 胁迫转录因子0sPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗 传与表达的转基因小麦植株。其具体通过以下步骤完成： I) 0SPHR2基因线性表达载体的构建； 2)将含有目的基因的线性载体转化小麦愈伤组织； 3)抗性再生植株的PCR鉴定。 进一步 步骤⑴具体为利用HindIII酶切含有0sPHR2基因的环状表达载体 pWMB003-0sPHR2,获得含有目的基因的线性载体，该片段长3kb，是只含有玉米Ubiquitin 启动子、0sPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。 步骤（2)具体为以郑麦0856的幼胚为受体材料，在MS诱导培养基暗培养4-5d后， 置于高渗培养基渗透处理4-6h，将含有目的基因线性载体和含有bar基因线性载体，利用 基因枪介导法共转化小麦愈伤组织，在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基， 培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基，连续筛选2代，筛选的抗性苗转至生根培养 基，生根、壮苗后移栽，获得抗性再生植株。 步骤（3)具体为提取再生植株的基因组DNA，根据0sPHR2基因序列设计了一对特 异性引物 PHR2P1 :5' -AATATGGAGGCTTTGAACC-3' 和 PHR2P2 :5' -TAACACACCCTTGGGAGTA-3'， 扩增程序为：95°C 2分钟；95°C 20秒，58°C 30秒，72°C 30秒，38个循环；72°C 10分钟，目 的片段长度为476bp ;PCR反应体系为：10-50ng/ul基因组模板；10 μΜ的PCl和PC2各 0·5μ1;2·5μ1 IOXReaction Bu ??θ；τ;4μ1 dNTP mix(2.5mM) ;0·5μ1 Taq 酶，加水至 25 μ 1〇 所述的MS诱导培养基为：MS+2mg/L 2, 4-D+O. 4%琼脂+3%蔗糖，ρΗ6· 2 ; 所述的高渗培养基为：MS+2mg/L 2, 4-D+0. 7%琼脂+甘露醇+3%蔗糖，ρΗ5· 8 ; 所述的草丁膦抗性筛选再生培养基为：l/2MS+0. 5mg/L ΝΑΑ+2. Omg/L ΚΤ+0. 4%琼 脂+3%蔗糖+4%??1'，？册.2; 所述的生根培养基为：l/2MS+0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 4%琼脂+3%蔗糖，pH6. 5。 本专利技术还提供了一种含有目的基因0sPHR2的线性表达载体，该片段长3kb，是只 含有玉米Ubiquitin启动子、0sPHR2基因和Nos终止子的线性最小表达框。 本专利技术的有益效果为：长期以来，国内外将小麦近缘种属和其它物种的磷高效基 因导入普通小麦的主要技术途径为通过远缘杂交方法，但一直未获得突破性进展。其主要 原因为近缘种属和其它物种与小麦之间存在着生殖隔离。本专利技术技术方案可以打破物种之 间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良 瓶颈问题的主要技术途径。、【附图说明】 图1是植物表达载体pWMB003-0sPHR2结构示意图； 图2是转0sPHR2基因小麦植株基因组DNA扩增电泳图；I :0sT5-l ;2,3,4,5 :阴性 植株；6 :0sT5-7 ;7 :0sT5-28 ;8 :0sT5-167 ;9 :0sT5-183 ;10 :受体郑麦 0856 ;11 :阳性对照； M：Marker ； 图3是转基因小麦株系目的基因0sPHR2的Southern杂交分析；M :1Kb DNALadder ;+ :阳性对照（质粒）；1，2, 3 :受体郑麦0856 ;4, 5, 6 :转基因株系OsT5-28 ; 1，4一BamHI 酶切；2, 5-KpnI 酶切；3, 6- SacI 酶切； 图4是转基因小麦0sPHR2基因的RT-PCR检测；，2, 3 :转基因株系0sT5-28 ;CK :未 转化对照（郑麦0856) ;A为0sPHR2基因的扩增产物，B为actin基因的扩增产物； 图5是转基因小麦株系0sT5-28旗叶Western杂交结果；1 :转基因株系0sT5-28 ; 2 :阳性对照水稻；WT :未转化对照（郑麦0856); 图6是不同条件下转基因小麦株系和对照的最长根长比较； 图7是不同条件下转基因小麦株系和对照的根鲜重比较。【具体实施方式】 下面结合实施例对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2在小麦中的应用，其特征在于：通过将水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2利用基因枪介导法导入到普通小麦品种郑麦0856中，获得可稳定遗传与表达的转基因小麦植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许为钢，毛传澡，李艳，齐学礼，王会伟，董海滨，吴忠长，
申请(专利权)人：河南省农业科学院小麦研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41