一种治疗圆锥角膜病的药物制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种以Nrf2-ARE信号通路为靶点的治疗圆锥角膜病的药物，该药物能够激活该信号通路，或提高下游抗氧化基因NQO-1、SOD2表达量，进而降低基质降解酶表达量，可用于圆锥角膜病的治疗。本发明专利技术采用甲基化抑制剂5-aza来治疗圆锥角膜病，可提高圆锥角膜基质细胞抗氧化基因的表达，同时降低基质降解酶的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗圆锥角膜病的药物
本专利技术属于眼科疾病治疗
，具体涉及一种以Nrf2-ARE信号通路为靶点的药物在圆锥角膜病治疗中的应用。
技术介绍
圆锥角膜(Keratoconus，KC)是一种以角膜扩张为特征，致角膜中央部向前凸出、变薄呈圆锥形并产生高度不规则散光的角膜病变。在组织病理学表现为角膜上皮细胞层变薄，Bowman’s膜和Descemet’s层撕裂，角膜基质层变薄、胶原含量下降和疤痕化。该病通常始发于青少年时期，患者早期多可以用框架镜屈光矫正视力；随病情发展，可戴硬性接触镜或者行角膜表层镜片术；晚期视力明显下降，需要进行角膜移植术得以恢复部分视力。圆锥角膜的病因至今不明，可能与多种原因，譬如眼表机械摩擦、接触镜的长期配戴、眼表过敏性炎症等有关，早期临床干预治疗尚是空白：即使临床早期诊断圆锥角膜后依然没有任何治疗和干预的方法，唯有等待疾病的自然发展，等角膜扩张到一定阶段，依赖硬性接触镜矫形暂时维持视力，后期严重阶段，角膜移植术是唯一可能得以恢复部分视力的方法，但是角膜移植术后可能存在免疫排斥反应和角膜植片慢性失功，从而导致植片混浊而需要再次接受角膜移植手术，并且角膜材料日益紧缺无疑延长了患者等待的时间和错失最佳的治疗时机，对患者的经济和身心影响都很大。本专利技术以圆锥角膜Nrf2-ARE信号通路活化缺陷为靶点，提供一种治疗圆锥角膜的药物，可用于该病的早期干预治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以Nrf2-ARE信号通路为靶点的治疗圆锥角膜病的药物，该药物能够激活该信号通路，提高下游抗氧化基因NQO-1、SOD2表达量，进而降低基质降解酶表达量，抑制圆锥角膜基质细胞胶原降解，可用于圆锥角膜病的治疗。本专利技术提供化合物或组合物的一种新用途，是在制备治疗圆锥角膜病的制品中的应用，其中所述的物质能够激活Nrf2-ARE信号通路；上述的化合物优选为甲基化抑制剂5’aza；异硫氰酸盐sulforaphane(SFN)；姜黄素Curcumin；多酚类黄酮epigallocatechingallate(EGCG)；作为优选，上述的制品为滴眼液；其中包含药理有效浓度的5’aza；SFN；Curcumin；EGCG；所述的制品还可以是注射液；作为优选，甲基化抑制剂5’aza的浓度为0.5、1μM。本专利技术采用甲基化抑制剂5’aza来治疗圆锥角膜病，本专利技术发现5’aza可提高圆锥角膜基质细胞抗氧化基因的表达，同时降低基质降解酶的含量，抑制圆锥角膜基质细胞胶原降解，可用于圆锥角膜的治疗。附图说明图1：圆锥角膜样本核内NRF2基因蛋白表达量高于正常角膜组。图2：圆锥角膜组样本HO-1，NQO-1，SOD2等抗氧化基因表达量低于正常角膜组。图3：圆锥角膜组样本ROS水平高于正常角膜组。图4：圆锥角膜组样本UPA，UPAR，MMP2等基质金属蛋白酶表达量高于正常角膜组。图5：外源添加甲基化抑制剂5’aza可提高圆锥角膜组样本NQO-1，SOD2抗氧化基因表达，同时降低UPA等基质降解酶表达。具体实施方式申请人在长期的研究中发现，细胞抗氧化应激反应的关键通路Nrf2-ARE信号通路在圆锥角膜中活化有缺陷，是圆锥角膜病治疗的新靶点。而能够激活该信号通路，提高下游抗氧化基因NQO-1、SOD2表达量的药物，具有治疗圆锥角膜的作用。本专利技术在圆锥角膜基质细胞培养的过程中加入甲基化抑制剂5’aza，能有效提高样本NQO-1等抗氧化基因表达量，同时降低UPA等基质降解酶的表达量，抑制圆锥角膜基质细胞胶原降解，可用于治疗圆锥角膜病，从而促成了本专利技术。实施例1：添加不同浓度5’aza对圆锥角膜基质细胞抗氧化基因的影响角膜组织采用Dispase(50mg/ml)4℃过夜处理，去除角膜上皮和内皮，角膜基质剪碎后采用胶原酶(1.25mg/ml)37℃消化6-8小时，吹打离散、离心、弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基37℃CO2培养箱内培养，0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA进行传代。在角膜基质细胞的分离培养过程中，取P3代细胞1X106按核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒(Thermo，78833)步骤提取细胞核蛋白，用wenternblot检测正常和圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白表达量。圆锥角膜样本核内nrf2基因表达量高于正常角膜组，见图1。取上述P3代细胞5X105，常规wenternblot检测正常和圆锥角膜基质细胞Nrf2下游抗氧化基因NQO-1，HO-1,SOD2蛋白表达量。另外收集上述细胞总RNA反转录为cDNA，采用实时定量PCR分析抗氧化基因表达情况。圆锥角膜样本抗氧化基因表达量低于正常角膜组，见图2。同时，圆锥角膜基质细胞活性氧水平ROS高于正常角膜基质细胞(图3)，圆锥角膜样本UPA,UPAR,MMP2等基质降解酶表达量高于正常角膜组，见图4。由此证明Nrf2-ARE信号通路活化缺陷为圆锥角膜治疗新靶点。在圆锥角膜基质细胞的分离培养过程中，加入不同浓度的甲基化抑制剂5’aza(0、0.5、1uM)，培养48h后，取细胞5X105，常规wenternblot检测圆锥角膜基质细胞Nrf2下游抗氧化基因NQO-1、SOD2蛋白表达量。5’aza处理后，圆锥角膜基质细胞的NQO-1、SOD2蛋白表达量高于未处理组。如图5。实施例2：添加不同浓度5’aza对圆锥角膜基质细胞基质降解酶表达的影响在圆锥角膜基质细胞的分离培养过程中，加入不同浓度的甲基化抑制剂5’aza(0、0.5、1μm)，培养48h后，取细胞5X105，常规wenternblot检测圆锥角膜基质细胞基质降解酶UPA的蛋白表达量。5’aza处理后，圆锥角膜基质细胞的uPA蛋白表达量低于未处理组，如图5。另外，采用胶原降解实验，在圆锥角膜基质三维胶原凝胶表面分别添加含纤溶酶原(100mg/L)及不同浓度(0、0.5、1μm)5’aza的培养液，培养48h，测定培养液中羟脯氨酸含量做为胶原降解活性，5’aza以剂量依赖关系减少圆锥角膜基质细胞胶原降解，可用于治疗圆锥角膜病。实施例3：添加不同浓度SFN对圆锥角膜基质细胞基质降解酶表达的影响在圆锥角膜基质细胞的分离培养过程中，加入不同浓度的SFN(0、5、10μM)，培养24h后，取1X106按核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒(Thermo，78833)步骤提取细胞核蛋白，用wenternblot检测药物处理后圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白表达量。另外取上述细胞5X105，常规wenternblot检测圆锥角膜基质细胞基质降解酶UPA的蛋白表达量。SFN处理后，圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白表达量提高；且药物处理后，圆锥角膜基质细胞UPA蛋白表达量低于未处理组。另外，采用胶原降解实验，在圆锥角膜基质三维胶原凝胶表面分别添加含纤溶酶原(100mg/L)及不同浓度(0、5、10μM)SFN的培养液，培养24h，测定培养液中羟脯氨酸含量做为胶原降解活性，SFN以剂量依赖关系减少圆锥角膜基质细胞胶原降解，可用于治疗圆锥角膜病。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物或组合物的用途，其特征在于，所述的用途是在制备治疗圆锥角膜病的制品中的应用，其中所述的物质能够激活Nrf2‑ARE信号通路。

【技术特征摘要】
1.一种甲基化抑制剂5-aza和/或异硫氰酸盐在制备抑制圆锥角膜基质细胞胶原降解的制品中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲明俐，周庆军，边江，王瑶，杨玲玲，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37