耐氧夏普氏菌及其在二氢大豆异黄酮有氧合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976及其在二氢黄豆苷原和二氢染料木素有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养；（2）底物黄豆苷原或染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明专利技术耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21能够在有空气氧的条件下将黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原，也能将染料木素高效转化为二氢染料木素，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，能够实现二氢黄豆苷原和二氢染料木素在有空气氧条件下的高效生产。

【技术实现步骤摘要】
耐氧夏普氏菌及其在二氢大豆异黄酮有氧合成中的应用
本专利技术涉及微生物

技术介绍
大豆异黄酮（soybeanisoflavones）是大豆等豆科植物在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，主要存在于大豆种子的子叶和胚轴中。目前从大豆中分离并得到结构鉴定的异黄酮共有12种，包括9种异黄酮葡萄糖苷和3种相应的糖苷配基（Wangetal1994，JAgricFoodChem，42:1666-1673）,即黄豆苷原（daidzein）、染料木素（genistein）和黄豆黄素（glycitein），其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%以上，为大豆异黄酮苷元主要成分。大量流行病学研究证实，大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、降低心脑血管发病率、减少骨质流失以及缓解妇女更年期综合症等多种生理或药理功能。被哺乳动物摄入体内的大豆异黄酮极少能直接被胃肠黏膜吸收，大部分在糖苷酶作用下从结合型糖苷变为游离型苷元，然后在肠道微生物菌群作用下被转化为各种不同代谢产物。其中大豆异黄酮黄豆苷原可被转化为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）、四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin）和雌马酚（equol）等代谢产物（Joannouetal1995，JSteroidBiochemMolBiol，54:167-184）；染料木素被代谢为二氢染料木素（dihydrogenistein，简称DHG）、4-乙基苯酚(4′-propionicacid)和5-羟基-雌马酚（5-hydroxy-equol）等代谢产物（Coldhametal1999，JSteroidBiochemMolBiol，70:168-184）。目前已知，由微生物代谢黄豆苷原产生的DHD是高活性植物雌激素雌马酚的生物合成前体。在以往研究中从人肠道菌群中分离了一株能将DHD转化为雌马酚的严格厌氧爱格氏菌属菌株Eggerthellasp.Julong732，该菌株不能将DHD前体黄豆苷原转化为雌马酚，但能将黄豆苷原代谢产物DHD转化为雌马酚(Wangetal2005，ApplEnvironMicrobiol，71:214-219)，这为DHD是合成雌马酚的前体提供了直接证据。同样地，DHG也是5-羟基-雌马酚合成的前体。专利文献CN103275884B公开了一株从鸡粪中分离的能将底物染料木素转化为5-羟基-雌马酚的厌氧史雷克氏菌Slackiasp.AUH-JLC159（又称斯奈克氏菌AUH-JLC159），该菌株也能将染料木素代谢产物DHG转化为5-羟基-雌马酚，表明DHG是5-羟基-雌马酚生物合成的前体。DHD和DHG是大豆异黄酮被微生物代谢时必经的首步代谢产物，有关DHD和DHG生物学功能也有研究报道。如DHD被报道是保持血管活性的成分之一，由于它与17-β雌二醇的结构相似，从而能有效的抑制血管收缩，防止内皮组织受伤害（Becketal2005，JSteroidBiochem，94:499-518）。此外，Chin-Dusting等2001年（BritJPharm，133:595-605）以及Jiang等2003年（JVascRes，40:276-284）分别分析比较了黄豆苷原及包括黄豆苷原加氢产物DHD等不同代谢产物对心脑血管的保护作用，研究结果均表明DHD对心脑血管的保护作用远高于其亲本化合物黄豆苷原。此外，试验结果还表明，DHD和DHG与其亲本化合物黄豆苷原和染料木素相比，水溶性明显增加，一定浓度下（浓度不低于3.33毫摩尔/升）的DHD和DHG体外清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）能力均显著高于其亲本化合物黄豆苷原和染料木素(Liangetal，2010,JAgricFoodChem，58:11548-11552)。大豆异黄酮代谢产物DHD和DHG目前可进行人工化学合成，但由于所用催化剂价格昂贵，致使目前市场售价较高。目前，已从不同动物肠道微生物菌群中分离得到多株能将底物黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的细菌菌株，然而这些菌株均为严格厌氧细菌菌株。由于从黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的反应为加氢还原反应，因此，厌氧菌在转化时必须保证严格的厌氧环境，而长期维持严格厌氧环境造价极高。文献“大豆异黄酮还原菌株耐氧突变株的耐氧机制与有氧转化调控”中，尝试对已分离的能将黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的严格厌氧菌株进行耐氧驯化，并将从牛瘤胃分离的具有上述转化功能的细菌菌株Niu-O16成功驯化为耐氧突变株Aeroto-Niu-O16，该耐氧突变株在有空气氧条件下既能生长，又能将底物黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG。但是，由于该耐氧突变株耐氧机制之一就是在氧气刺激下在其菌体外壁形成一层以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构，这层抗氧化“保护膜”结构有力的阻挡了氧气进入菌体细胞内，进而大大降低了氧气对菌体造成的伤害。然而，由于菌体转化时产生的酶为胞内酶，底物黄豆苷原和染料木素需进入菌体内部，在菌体内部被转化为产物后再运出菌体。以往研究表明，这层抗氧化“保护膜”结构严重阻碍了底物（与染料木素比，底物黄豆苷原尤为突出）从菌体外转运到菌体内，加之底物黄豆苷原和染料木素水溶性较差，大量底物（尤其是底物黄豆苷原）被阻滞在这层抗氧化“保护膜”中了，而被阻滞在抗氧化“保护膜”中的底物不能被有机溶剂（如乙酸乙酯）有效萃取出来，这使得产物DHD和DHG的量大大降低，尤其是DHD降低更明显。加入底物浓度越大，形成的抗氧化“保护膜”结构导致的产物量损失越大（Zhaoetal2011，ApplMicrobiolBiotechnol，92:803-813），因此，耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在实际生产中不具有可应用性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种耐氧突变菌Aeroto-AUH-JLD21及其在二氢黄豆苷原和二氢染料木素有氧合成中的应用。该菌株能在自然条件（有空气氧条件）下，将底物黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD），也能将底物染料木素高效转化为二氢染料木素（dihydrogenistein，简称DHG），转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，能够实现二氢黄豆苷原和二氢染料木素在有空气氧条件下的高效生产。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种耐氧夏普氏菌（sharpeasp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCCNo.9976。耐氧夏普氏菌sharpeasp.Aeroto-AUH-JLD21是由保藏号为CGMCCNo.5306的严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21（EU919864）经过长期耐氧驯化后得到的耐氧突变株。该耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在有空气氧条件下既能快速生长又能将底物黄豆苷原和染料木素分别高效转化为DHD和DHG。有关底物黄豆苷原和染料木素以及它们的转化产物DHD和DHG的结构如下：本专利技术中的耐氧夏普氏菌sharpeasp.Aeroto-AUH-JLD21菌株（简称耐氧菌株Aerot本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto‑AUH‑JLD21，保藏号为CGMCC No.9976。

【技术特征摘要】
1.一种耐氧夏普氏菌（sharpeasp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCCNo.9976。2.如权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用。3.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18～24小时；再以10%接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15%接种量接种到添加0.10%L-半胱氨酸和0.10%抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为1.2～2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1～2天；（3）代谢产物的分离纯化用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀伶，谢雁景，杨露，赵慧，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13