石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法技术

本发明专利技术涉及石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法。将酶与电化学发光试剂Ru(bpy)32+协同固定在石墨烯、PEDOT及PSS功能化纳米膜上。通过静电引力作用，带正电荷的Ru(bpy)32+有效固定在带负电荷的电极表面。作为电子高速传输通道的石墨烯具有高度共轭、强疏水性及大表面积的独特优势，为吡啶钌的有效固定提供良好平台。高电导性的PEDOT作为优秀导电膜材料改善了复合纳米膜的导电性。石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇具有节省试剂、灵敏度高、选择性好以及操作简单的优势。对乙醇标准溶液检测的线性范围为2.5×10–5-2.5×10–2mol/L，检测下限为2.5×10-6mol/L。

【技术实现步骤摘要】
石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法
本专利技术属于电化学发光检测
，具体涉及石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法。
技术介绍
吡啶钌电化学发光检测因具有灵敏度高、背景信号低、时空可控性好等优势受到广泛关注。由于Ru(bpy)32+可以在电极表面再生，因此通过将其固定在不同基质表面构建固态电化学发光传感器，不仅能够减少试剂消耗，降低检测成本，还可以增强电化学发光灵敏度，简化实验设计。固态电化学发光与酶的高选择性为样品的分析提供了一个无试剂化灵敏检测平台。尽管复杂的层层固定与自组装技术可以保持酶的活性，然而复杂的设计过程限制了该技术的广泛应用。为了在不同基质上构建稳定灵敏的电化学发光生物传感器，酶与Ru(bpy)32+协同固定技术被发展，如Nafion技术、溶胶凝胶方法以及壳聚糖手段的发展，然而这类电化学发光生物传感器因基质导电能力差影响了电子传输速度，因此迫切需要开发具有良好导电基质的电化学发光生物传感器。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种选择性好、节省试剂、灵敏度高以及操作简单的石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法。石墨烯是世上最薄也是最坚硬的纳米材料，它几乎完全透明然而却有着卓越的电子传输能力。石墨烯以其独特的纳米结构和无以伦比的性质开拓了纳米科学与纳米技术的新领域。聚合物PEDOT是一种高电导率的膜材料，掺杂水溶性的高分子电解质PSS可以有效改善PEDOT的溶解性，从而获得电导率高、机械强度好、光透射率强以及稳定性优越的PEDOT-PSS膜。石墨烯、PEDOT以及PSS技术的复合利用具有广泛的应用前景。1石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法，其特征在于步骤和条件如下：1.1检测步骤和条件1.1.1仪器装置电化学发光综合分析仪，西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；铂丝对电极；Ag／AgCl参比电极；1.1.2试剂及材料三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，乙醇脱氢酶(ADH)，β-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NaH2PO4，Na2HPO4，氨水，联氨；聚3，4-乙撑二氧噻吩(PEDOT)；聚苯乙烯磺酸(PSS)；氧化石墨烯；1.1.3相关溶液的制备(1)NAD+溶液制备；(2)磷酸盐缓冲溶液制备；(3)背景溶液的制备；(4)乙醇标准溶液的制备；(5)检测样品溶液的制备；1.1.4修饰电极溶液的制备(1)PEDOT-PSS混合溶液的制备；(2)PEDOT-PSS-G(G代表石墨烯)混合溶液的制备；(3)ADH溶液的制备；(4)NAD+溶液制备；(5)修饰电极溶液的制备；(6)Ru(bpy)32+溶液制备；1.1.5石墨烯电化学发光生物传感器的制备1.1.5.1ITO电极的准备1.1.5.2石墨烯电化学发光生物传感器的制备1.1.6检测步骤1.1.6.1乙醇标准溶液的循环伏安实验1.1.6.2白酒样品中乙醇的检测有关白酒样品检测的电化学发光谱图见图1。本专利技术涉及石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法。将酶与电化学发光试剂Ru(bpy)32+协同固定在预先由石墨烯、PEDOT以及PSS功能化的纳米膜上。通过静电引力作用，带正电荷的Ru(bpy)32+可以有效固定在带电极表面。作为电子高速传输通道的石墨烯具有高度共轭、强疏水性以及大表面积的独特优势，也为吡啶钌的有效固定提供良好的平台。高电导性的PEDOT作为一种优秀的导电膜材料改善了复合纳米膜的导电性。石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇具有节省试剂、灵敏度高、选择性好以及操作简单的优势，对乙醇标准溶液检测的线性范围为2.5×10-5-2.5×10-2mol／L，检测下限为2.5×10-6mol／L。已被成功用于实际白酒样品中乙醇含量的测定。有益效果：本专利技术所涉及的石墨烯电化学发光生物传感器检测白酒样品中乙醇的方法，同其它检测方法比较有如下特点：1)节省试剂，降低检测成本。本专利技术采用石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇，在石墨烯电化学发光生物传感器制备过程中，修饰电极溶液包含了生物分子、石墨烯纳米材料、PEDOT导电成膜材料等诸多成分，然而修饰电极溶液用量仅为8μL。而且，Ru(bpy)32+的用量也相当节省，电极在Ru(bpy)32+溶液中浸泡数秒就可取出。与其它固定技术相比，本专利技术的石墨烯电化学发光生物传感器的制作过程具有节省试剂，检测成本低的优势。2)灵敏度高。吡啶钌电化学发光可逆、高效，且无背景光源干扰。石墨烯具有卓越的电子传输能力，PEDOT作为高电导率的膜材料提供了良好的微环境，石墨烯、PEDOT、吡啶钌的协同作用为灵敏检测乙醇提供技术保障。与以前的Nafion等固定技术相比，本专利技术的检测灵敏度提高近1个数量级。3)选择性好。乙醇在辅酶的存在下，与乙醇脱氢酶作用产生还原型辅酶I(NADH)，NADH能与吡啶钌发生电化学发光共反应，增强吡啶钌的电化学发光。本专利技术对乙醇的检测具有良好选择性。4)简化实验装置。采用石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇，比以前文献报道的将吡啶钌和生物分子分别固定在不同的膜中的方法要简单。而且采用电化学发光综合分析仪的基本操作平台，辅助一些实验室常用的化学试剂即可完成检测任务。石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇具有节省试剂、灵敏度高、选择性好以及操作简单的优势，对乙醇标准溶液检测的线性范围为2.5×10-5-2.5×10-2mol／L，检测下限为2.5×10-6mol／L。已被成功用于实际白酒样品中乙醇含量的测定。附图说明图1是对酒样品进行检测的电化学发光谱图。具体实施方式实施例1白酒中乙醇的检测1.1检测步骤和条件1.1.1仪器装置电化学发光综合分析仪，西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；铂丝对电极；Ag／AgCl参比电极；1.1.2试剂及材料三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，乙醇脱氢酶(ADH)，β-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NaH2PO4，Na2HPO4，氨水，联氨；聚3，4-乙撑二氧噻吩(PEDOT)；聚苯乙烯磺酸(PSS)；氧化石墨烯；1.1.3相关溶液的制备(1)NAD+溶液制备用二次水配制1.25×10-3mol／LNAD+溶液；(2)磷酸盐缓冲溶液制备配制浓度为200.0mmol／L的NaH2PO4溶液和浓度为200.0mmol／L的Na2HPO4溶液，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol／L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50；(3)背景溶液的制备将步骤1.1.3(1)制备的NAD+溶液与步骤1.1.3(2)制备的磷酸盐缓冲溶液混合，用二次水稀释获得背景溶液；背景溶液中NAD+浓度为1.25×10-4mol／L，磷酸盐浓度为20mmol／L；(4)乙醇标准溶液的制备将步骤1.1.3(1)制备的NAD+溶液与步骤1.1.3(2)制备的磷酸盐缓冲溶液混合；加入乙醇，用二次水稀释，获得乙醇标准溶液；其中NAD+浓度为1.25×10-4mol／L，磷酸盐浓度为20mmol／L，乙醇的浓度为2.5×10-3mol／L；(5)白酒检测样品溶液的制备将步骤1.1.3(1)制备的NAD+溶液与步骤1.1.3(2)制备的磷酸盐缓冲溶液混合；然后加入10μL白酒样品，用二次水稀释至400μL，获得白酒检测样品溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法，其特征在于步骤和条件如下：检测步骤和条件仪器装置电化学发光综合分析仪；铂丝对电极；Ag/AgCl参比电极；试剂及材料三联吡啶钌的六水合氯化物（Ru(bpy)32+），乙醇脱氢酶 (ADH)，β‑尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)，NaH2PO4，Na2HPO4，氨水，联氨；聚3,4‑乙撑二氧噻吩（PEDOT）；聚苯乙烯磺酸(PSS)；氧化石墨烯；溶液的制备（1）NAD+溶液制备用二次水配制1.25×10‑3 mol/L NAD+溶液；（2）磷酸盐缓冲溶液制备配制浓度为200.0 mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为200.0 mmol/L的 Na2HPO4溶液，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50；（3）背景溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD+溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合，用二次水稀释获得背景溶液；背景溶液中NAD+浓度为1.25×10‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L；（4）乙醇标准溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD+溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；加入乙醇，用二次水稀释，获得乙醇标准溶液；其中NAD+浓度为1.25×10‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L，乙醇的浓度为2.5×10‑3 mol/L；（5）检测样品溶液的制备将步骤1.1.3（1）制备的NAD+溶液与步骤1.1.3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；然后加入10 μL酒样品，用二次水稀释至400 μL，获得检测样品溶液；检测样品溶液中NAD+浓度为1.25×10‑4 mol/L，磷酸盐浓度为20 mmol/L；1.1.4修饰电极溶液的制备（1）PEDOT‑PSS混合溶液的制备将1 mL的PEDOT与6 mL的PSS超声混合，配制成PEDOT‑PSS混合溶液；（2）PEDOT‑PSS‑G（G代表石墨烯）混合溶液的制备将步骤1.1.4（1）制备的PEDOT‑PSS混合溶液1.3 mL加入到1.25 mL氧化石墨烯中, 依次加入40 µL氨水和3.5 µL联氨，混合均匀；在容量瓶中用二次水稀释，定容至10 mL，获得的PEDOT‑PSS‑G混合溶液；（3）ADH溶液的制备将1mg ADH 溶解在100 μL二次水中，获得ADH 溶液；（4）NAD+溶液制备用二次水配制浓度为0.025 mol/L的NAD+溶液；（5）修饰电极溶液的制备将步骤1.1.4（3）获得的ADH 溶液20 μL与1.1.4（4）制备的NAD+溶液10 μL，以及步骤1.1.4（2）获得的PEDOT‑PSS‑G混合溶液20 μL共同混合，得到修饰电极溶液；（6）Ru(bpy)32+溶液制备用二次水配制浓度为 0.8 mmol/L的Ru(bpy)32+溶液；的制备电极的准备将ITO电极用无水乙醇超声洗涤三次，再用二次水清洗三次，最后用氮气吹干；以聚二甲基硅氧烷为模板，将ITO电极固定为直径是10 mm的圆形；的制备取由步骤1.1.4（5）制备的修饰电极溶液8 μL涂覆在由步骤1.1.5.1制备的直径为10 mm圆形ITO电极上；室温条件下干燥，获得含复合膜的ITO电极；将含复合膜的ITO电极浸入由步骤1.1.4（6）制备的浓度为0.8 mmol/L Ru(bpy)32+溶液中，浸泡10 s后取出，在室温条件下干燥，获得石墨烯电化学发光生物传感器，将其贮存在4°C冰箱中备用；1.1.6 检测步骤1.1.6.1 乙醇标准溶液的循环伏安实验以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，在步骤1.1.3（3）获得的背景溶液中循环扫描5 ‑ 10周，扫描电位区间是0 ‑ 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，用由步骤1.1.3（4）获得乙醇标准溶液进行循环扫描5‑ 10周，扫描区间同样为0 ‑ 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；将乙醇标准溶液获得的循环伏安曲线与背景溶液得到的循环伏安曲线进行比较，以确定测定检测乙醇的电化学活性区间；白酒样品中乙醇的检测将步骤1.1.3（5）得到的检测样品溶液按下述条件进行检测：电化学发光检测池位于光电倍增管上方；光电倍增管偏置电压设为800 V；扫描电位设置为0 ‑ 1.25 V；将步骤1.1.3（5）获得的检测样品溶液400μL添加到电化学发光检测池中；以步骤1.1.5.2制备的石墨烯电化学发光生物传感器作为工作电极，铂丝为对极，Ag/AgCl为参比电极；获得白酒样品中乙醇检测的电化学发光图谱。...

【技术特征摘要】
1.石墨烯电化学发光生物传感器检测乙醇的方法，其特征在于步骤和条件如下：检测步骤和条件A1仪器装置电化学发光综合分析仪；铂丝对电极；Ag/AgCl参比电极；A2试剂及材料三联吡啶钌的六水合氯化物（Ru(bpy)32+），乙醇脱氢酶(ADH)，β-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NaH2PO4，Na2HPO4，氨水，联氨；聚3,4-乙撑二氧噻吩（PEDOT）；聚苯乙烯磺酸(PSS)；氧化石墨烯；A3相关溶液的制备（1）NAD+溶液制备用二次水配制1.25×10-3mol/LNAD+溶液；（2）磷酸盐缓冲溶液制备配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4溶液，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.50；（3）背景溶液的制备将步骤A3（1）制备的NAD+溶液与步骤A3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合，用二次水稀释获得背景溶液；背景溶液中NAD+浓度为1.25×10-4mol/L，磷酸盐浓度为20mmol/L；（4）乙醇标准溶液的制备将步骤A3（1）制备的NAD+溶液与步骤A3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；加入乙醇，用二次水稀释，获得乙醇标准溶液；其中NAD+浓度为1.25×10-4mol/L，磷酸盐浓度为20mmol/L，乙醇的浓度为2.5×10-3mol/L；（5）检测样品溶液的制备将步骤A3（1）制备的NAD+溶液与步骤A3（2）制备的磷酸盐缓冲溶液混合；然后加入10μL酒样品，用二次水稀释至400μL，获得检测样品溶液；检测样品溶液中NAD+浓度为1.25×10-4mol/L，磷酸盐浓度为20mmol/L；A4修饰电极溶液的制备（1）PEDOT-PSS混合溶液的制备将1mL的PEDOT与6mL的PSS超声混合，配制成PEDOT-PSS混合溶液；（2）PEDOT-PSS-G（石墨烯）混合溶液的制备将步骤A4（1）制备的PEDOT-PSS混合溶液1.3mL加入到1.25mL氧化石墨烯中,依次加入40µL氨水和3.5µL联氨，混合均匀；在容量瓶中用二次水稀释，定容至10mL，获得的PEDOT-PSS-G混合溶液；（3）ADH溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：向前，杨晓东，高英，李敬，唐娟，吴仙花，杨焕欣，
申请(专利权)人：长春工程学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22