快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法技术

本发明专利技术属于分子标记领域，公开了一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，包括：1、提取药材DNA；2、用一对扩增核糖体 DNA 的内转录间隔区ITS2序列的正反向引物进行PCR扩增；3、限制性内切酶NCO I消化PCR产物；4、琼脂糖凝胶电泳分析。药材三叶青DNA扩增产物酶消化后产生2条DNA片断，大小分别为335bp和200bp左右，而各种伪混品均不被NCO I酶识别。本发明专利技术利用三叶青与其伪混品DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法, 可鉴别三叶青药材及是否混入了伪混品，克服了感官或理化分析等方法难以鉴别三叶青真伪的技术问题，保障了三叶青药材用药安全。

【技术实现步骤摘要】
快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法
本专利技术属于分子标记
，尤其涉及一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法。
技术介绍
三叶青(Tetrastigmahemsleyanum)又名金线吊葫芦，是葡萄科崖爬藤属多年生草本植物，其地下块根为主要药用部位，可用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病,也是抗肿瘤常用药物。目前该植物野生资源濒临灭绝，且其对生长环境的要求非常苛刻，人工栽培难度大，开发和利用受到极大限制。由于资源稀缺而需求量大，三叶青价格不断攀升，药材市场上出现了土圞儿、大青藤、乌头子根等多种伪混品，药材质量极不稳定，甚至发生了患者服用混有乌头子根的假劣三叶青药材中毒的现象。为保证中药药材质量和用药安全，对三叶青药材基原植物的鉴定非常重要。目前中药材传统的鉴定手段大多采用的是依据其外部形态和显微结构，但是由于植物子根类药材大多外部形态相似，且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出其本身的形状和颜色，显微特征也有不同程度的破坏，造成鉴定困难。中药材种质分子鉴定技术不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，实验过程标准化，操作简单快速。中国专利申请201310373809.4公开了一种鉴定药用植物三叶青的方法，这是基于ISSR分子标记的三叶青分子鉴定方法。该技术通过一对特异性引物扩增与否可成功鉴别三叶青常见伪混品，但对其某些近缘物种也有阳性结果，区分度不高，且未验证在大青藤、乌头子根等常见伪混品鉴定中的适用性，另外需要事先合成一对特异性引物。植物核rDNA的内转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)包含被5.8SrDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段，PCR扩增已有通用引物序列，且测序简单易行，ITS序列变异较快，可以提供较丰富的变异位点和信息位点。PCR-RFLP用于近缘种的鉴别已有一些成功范例，具有快速、简单、准确等优点，但这种鉴别对不同的物种，所用的引物、PCR扩增条件、限制性内切酶的种类及鉴别方法都不相同。目前尚没有应用PCR-RFLP技术对三叶青进行分子鉴别的报道。DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA短片段进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。DNA条码概念是2003年由加拿大动物学家PaulHebert首先提出，利用有足够变异且容易扩增的相对较短的标准DNA片段，在种内的特异性与种间的多样性中建立的一种新的生物身份识别系统，从而实现了对物种进行快速、准确的识别和鉴定。DNA条形码的理想序列有3个基本判断标准：(1)序列变异水平适宜，可以将不同物种彼此区分开来，同时种内变异较小；(2)变异区域两端的序列高度保守，可以设计在众多物种中稳定扩增的通用引物；(3)扩增序列尽量短，最好一个反应可以完成测序。DNA条形码不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，实验过程标准化，并可通过数据库实现共享并可将DNA序列转换成二维条形码图像应用于实践。迄今热点候选序列有rbcL、matK、psbA-trnH、ITS2等，但还未获得广泛通用的植物DNA条形码标准片段。符渊森等研究发现ITS、bcL+matK+ITS是鉴定三叶青和其它崖爬藤属植物的最佳条形码，三叶青可以被ITS、ITs+rbcL、ITS+matK、ITs+trnH-psbA、matK+rbcL、；bcL+trnH-psbA及2+x组合条形码准确鉴定(《药用植物三叶青的种质鉴定和组培快繁研究》，浙江大学硕士学位论文，2011年)。该方法首先需要提取植物DNA，再进行PCR扩增，通过对扩增产物测序和比对才能判断该植物的种类，不适合快速鉴定。目前Genbank中只有其它崖爬藤属植物毛枝崖爬藤、扁担藤等的ITS2基因序列，还没有三叶青ITS2的相关基因序列，因此本领域特别需要建立中药三叶青的快速鉴定方法。本专利技术提供的PCR-RFLP方法能实现三叶青的快速鉴定，提高鉴定结果的准确性。
技术实现思路
为了建立中药三叶青及其伪混品的快速鉴定方法，实现中药三叶青的DNA条形码检测，本专利技术通过以下方法实现本专利技术的目的。建立了一种快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR-RFLP方法，包括提取药材DNA和琼脂糖凝胶电泳分析，用一对扩增核糖体DNA的内转录间隔区(ITS2)序列的正反向引物进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品。本专利技术所述PCR扩增基因为核糖体DNA的内转录间隔区(ITS2)，为SEQIDNO.3所示的基因序列。本专利技术PCR扩增引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，其中正向引物为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，反向引物为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。使用的限制性内切酶为NcoⅠ，其识别序列为CCATGG。PCR扩增的基因片段大小为400～600bp，其中优选的为490～550bp，特别优选的为533bp。限制性内切酶消化后药材三叶青样品电泳分析出现335bp和200bp条带，而其伪混品的DNA扩增产物不被限制性内切酶消化。本专利技术所述的PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30秒，45～55℃退火30秒，72℃延伸40秒，25～35个循环；最后72℃延伸10分钟。其中优选的退火温度为55℃，优选的PCR循环为35个。PCR扩增产物的限制性内切酶酶切反应条件为：10μLPCR产物，2μL10×酶切缓冲液，8μL灭菌超纯水，5～25U限制性内切酶，20～37℃恒温2～8小时，其中优选的限制性内切酶加入量为20U，反应温度37℃，时间为4小时。本专利技术提供的快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR-RFLP方法能实现三叶青的快速鉴定，提高鉴定结果的准确性，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：1、本专利技术所提供的方法能快速有效的实现三叶青的真伪鉴定。与传统的形态学鉴定方法及其它分子标记方法相比，能有效缩短三叶青的鉴定时间，采用本专利技术方法鉴定需要6～8h时间,达到了快速鉴定的目的，因为利用DNA序列差异进行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，增加了对近缘物种的分辨率，大大增加了鉴定的准确性。2、本专利技术提供了鉴定所需的一对PCR通用引物的反应条件、一种限制性内切酶及酶切反应条件，与现有的三叶青分子鉴别方法相比，本专利技术对市场上目前发现的所有三叶青伪混品以及其同属近缘物种均能实现有效鉴别。附图说明图1是琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物结果；泳道1：DNAMarker，自上而下400bp、500bp、700bp、900bp、1500bp；泳道2：来自浙江丽水三叶青样品；泳道3：来自浙江温岭三叶青样品；泳道4：来自浙江象山三叶青样品；泳道5：来自广西田林三叶青样品；泳道6：来自广西乐业三叶青样品；泳道7：来自湖南邵阳三叶青样品；泳道8：来自湖南益阳三叶青样品；泳道9：来自湖南沅陵三叶青样品；泳道10：来自江本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR‑RFLP方法，包括提取药材DNA和琼脂糖凝胶电泳分析，其特征在于，用一对扩增核糖体 DNA 的内转录间隔区（ITS2）序列的正反向引物进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR-RFLP方法，包括提取药材DNA和琼脂糖凝胶电泳分析，其特征在于，用一对扩增核糖体DNA的内转录间隔区序列的正反向引物进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品，其判断标准为酶消化后药材三叶青样品电泳分析出现335bp和200bp条带，而其伪混品的DNA扩增产物不被限制性内切酶消化；所述的三叶青伪混品是土圞儿、乌头、大青藤、三叶青近缘植物扁担藤、毛枝崖爬藤；上述PCR扩增引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所述的核苷酸序列，其中正向引物为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，反向引物为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；使用的限制性内切酶为NCOⅠ，其识别序列为CCATGG。2.如权利要求1所述的一种快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述PCR扩增基因为核糖体...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昕，吉庆勇，张煜炯，范三微，何军邀，
申请(专利权)人：浙江医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：浙江;33